纯化

1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220 rpm培养。 

2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃ 220 rpm培养至OD600≈0.4-0.5。

3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。

4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻存）。

5.配制buffer A，如下

7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。

8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）

9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。

10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。

11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

Wash buffer:  buffer A+20mM imidazole

12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer， 放置10min后洗脱。为了确保蛋白全部洗脱下来，可以边洗脱边用考马斯亮蓝法检测蛋白，当不再变蓝时，就不用再洗脱了。

Elution buffer：buffer A+250mM imidazole (imidazole 浓度高时，用浓HCl调pH值)

11. elution 后的蛋白分装成50-100uL/管，冻于-80℃，避免反复冻融。取5-10uL电泳检测蛋白表达量。

蛋白浓缩步骤：

将提纯的蛋白加入浓缩管中（10），3000g，4℃，第一次离心10min（用bradford检测废液中是否有蛋白）。边离心边检测， 至终体积约为700uL。用200uL吸出蛋白，注意不要碰到膜，检测蛋白的终浓度。

FPLC

1、用buffer A 平衡分子筛，flow rate: 0.5; pressure <1.2，时间大约1h。

2、将浓缩好的蛋白离心5min，上清用注射器加入进样孔。

3、收集峰值很好的蛋白，取出跑电泳，染色，检测是否有目的条带，纯度如何。

4、选取纯度最好的蛋白，浓缩后测量浓度，计算得率。

5、若蛋白浓度和纯度达到标准，即可进行结晶实验。

上样：

Pump   flow 0.5ml/min  insert

Flowpath  inject 

Alarm alarm pressure <1.5Mpa

Fraction   size 0.5ml

End time acu volume 25ml

Execute

 A 泵放水中，pump wash  pump A insert

DLS（动态光散射）

判断纯化蛋白的分子量大小。

结晶蛋白 

TIPS:

1、Lysis buffer 多加一点， 50mL/L 菌。

2、离心时间长一点   45min 10000rpm

3、5个柱体积洗beads

4、Binding 1h. Binding后先倾斜放，等beads 沉下去后把beads先吸到预装柱里，再把上清加进去。

5、10个柱体积wash, 注意不要破坏柱床。

6、5个柱体积洗脱。一般第二次最浓，边洗脱边用Bradford检测，不变蓝就不用再洗脱了。          1ml+1ul蛋白   变色？

7、浓缩<3000g（千万不要超过），一般用3500rpm 就可以了。下载本文