Lab1.Blood cell agglutination

摘要：细胞凝集指的是细胞与细胞之间通过某种凝集素的作用而相互粘连在一起的现象，最终形成大的细胞团块。而凝集素由于可使细胞凝集而成为一种重要实验和临床试剂。本次实验就是通过进行对兔血细胞的凝集操作，观察细胞凝集现象，并掌握凝集素促进细胞凝集的实验原理和操作方法。

关键词：细胞凝集、凝集素

前言：凝集素是一类能专一识别糖并与之非共价可逆结合的非酶非抗体蛋白质。凝集素是指从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞，故名凝集素。凝集素按来源可分为植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素三大类 ;植物凝集素分为7个家族：豆科凝集素、几丁质结合凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、2型核糖体失活蛋白、木菠萝素家族、葫芦科韧皮部凝集素和苋科凝集素；动物凝集素按分子结构分为C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素等。

在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出的寡糖链，形成细胞外被（又称为糖萼）。凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。其反应机制如下图：

凝集素在生化、医学等方面有广泛的应用：

1.凝集素在实验室中经常被用来分离、纯化蛋白质  植物凝集素的功能是结合细胞表面上的糖蛋白，动物凝集素的功能包括结合可溶性的细胞外或细胞内糖蛋白。凝集素在实验室中经常用来分离、纯化糖蛋白。这是由于植物凝集素能专一性地、非共价地可逆结合糖蛋白中不同类型的糖链结构，所以首先分别用凝集素亲和层析方法分离富集正常细胞和癌细胞的细胞裂解液中的糖蛋白，从细胞裂解物中高通量的分离出N-糖苷键型糖蛋白之后，再利用双向凝胶电泳技术对于被凝集素吸附的糖蛋白进行分离，最后利用质谱技术进行鉴定。

2.凝集素介导细胞与细胞、细胞与基质的粘附  选凝素是一类Ca2+依赖的、能与特异糖基识别并结合的细胞粘附分子，主要介导白细胞与血管内皮细胞或血小板的识别和粘附。选凝素N-末端凝集素结构域可识别特异的寡糖基，是选凝素参与细胞间选择性粘附的重要活性部位。选凝素C-末端胞内结构域可通过锚定蛋白与细胞内微丝结合，促进细胞粘附。通过这种粘附介导白细胞从血液迁移至组织内。

3.凝集素检测肿瘤细胞的细胞膜上的糖基化改变  肿瘤细胞膜上组分的改变，较重要的是糖蛋白及糖脂结构的改变，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标志和不同肿瘤的分化标记。凝集素还可以作为探针，监测肿瘤细胞的细胞膜上的糖基化改变，作为多种癌症检测的参考指标。

4.外源凝集素具有促有丝原作用  许多植物凝集素可作为有丝原，如PHA、ConA和美洲商陆凝集素，在免疫学中广泛用于刺激淋巴细胞的增殖。在临床上常用PHA来刺激人外周血的T细胞，观察T细胞增殖的程度，称为淋巴细胞转化试验，是一种细胞免疫功能的体外检测方法。

5.纯化的凝集素能够用来鉴定血型  通常所说的血型就是红细胞的血型，是根据红细胞表面的抗原特异性来确定的。在人类的血浆（或血清）中含有凝集素（又称抗体）A、B。同名的抗原和凝集素相遇会发生红细胞凝集现象。所以在人体的血液中，所含的凝集原和凝集素的类型不同，可分为A、B、AB、O四种血型。纯化的凝集素能用来鉴定血型。

材料和方法：

试剂：

•PBS缓冲液（pH=7.2）

•土豆

•2%兔血红细胞悬液

工具、仪器：

•移液管

•载玻片

•显微镜

•离心机、离心管（本次实验并未用到）

方法：

♦土豆切片后，取2g放入10ml PBS溶液中浸泡2小时。土豆凝集素将会溶解于溶液中。（实验前已准备好了）

♦梯度稀释制备不同浓度（1X，0.5X和0X）的土豆凝集素悬液

♦取用抗凝血剂处理过的1ml的兔静脉血，加3ml的生理盐水，1000r/min离心5min，弃上清。（实验前也已准备好了）

♦将细胞沉淀悬浮于4ml生理盐水（注意不是PBS溶液），制成2%细胞悬液。通过系列稀释，将血细胞制成3种不同浓度（0.5%，1% 和 2%）的悬液。

♦按照如下表一所示，用移液管取一滴凝集素或PBS溶液于载玻片凹坑内，加上一滴红细胞悬液，漩摇混合。10min后于显微镜下观察。

表一• 各组中凝集素和血细胞的浓度

Table1• Lectin and RBC concentration in each group

          Lectin

图1.  在载玻片上所观察到的各组血细胞凝集现象

图2.  显微镜下细胞凝集形态（10x10）

实验结果描述：

1.土豆凝集素可以使血红细胞凝集，而且在红细胞浓度一定的情况下，凝集素浓度与凝集程度和凝集速度呈正相关。

2.由A-3、B-3、C-3可以得，PBS对血红细胞没有凝集作用。

3.由于时间与土豆凝集素没有明显关联，且凝集程度相似，所以当凝集素浓度一定的情况下，无法对土豆凝集素浓度和凝集程度和凝集速度的相关性进行判断。

补充实验：漩摇对细胞凝集的影响

方法：取B-1和B-2进行实验，记为B-1’和B-2’，不对其进行漩摇，静置10min其他步骤相同。

结果：

结论：不进行漩摇，血细胞依然可以进行凝集，但由图可以看出进行漩摇的一组凝集程度更好。根据实验书所述，若不进行漩摇，所要进行的操作是“静置20min”，也可以看出漩摇的效果更好，但静置20min和漩摇10min所达到的效果是否相同，由于没有进行实验，因此还有待考究。

讨论：

1.从实验结果上看，此次实验还是比较成功的，从血细胞凝集的宏观和微观两方面观察，都可以得到预期的结果，这应该是规范操作的结果。

2.这次实验也存在一定的瑕疵，首先是观察到的现象和时间的错乱，A-1两次的记录的时间相差也比较大，也没有进行进一步的实验验证，我也无法得出在土豆凝集素浓度及其他客观因素相同的条件下，血细胞浓度与凝集反应速率的相关关系。血细胞浓度与凝集反应速率这两者的关系，这是本次实验遗留下来的问题。原因有以下3点：一是用秒表计时，来回记录时间上会有误差，但也不会相差太大；二是不同的组员所进行的实验并不绝对同步，而且同样的实验前后两次做，会存在一定的误差；三是每个人的判断标准不尽相同，因而所记录的时间也会有所偏差；四是操作方式和习惯也会对实验结果带来一定的影响，比如每个人漩摇的力度不同等。

3.从这次实验中，我体会到了团队合作的重要性，默契的合作不仅对实验的结果有很大的帮助，对每个人的能力提高也发挥着重要作用。

4.由于是首次进行细胞生物学的实验，还是有些不适应，主要体现在进行实验操作和实验记录的分配上，这次的许多实验现象和凝集时间的漏记，对结果分析带来了一定的影响，相信这个问题会随着实验的进行迎刃而解。

5.此次实验我还有一个遗留的问题：根据实验结果，可以看到血细胞无论在2%和1%的凝集素浓度下都可以在5-6min之内完全凝集，最长的也不超过7min，那么可否对漩摇的时长进行适量的缩减，如果进行缩减，那会不会对实验结果产生影响，会产生怎样的影响？

参考文献：

韩贻仁 主编．2007．分子细胞生物学．第三版．北京：高等教育出版社

马文丽 主编．2012．生物化学．北京：科学出版社

王崇英　高清祥　主编．2011．细胞生物学实验．第三版．北京: 高等教育出版社

王镜岩 朱圣庚 徐长法 主编.2002．生物化学．第三版（上册）．北京: 高等教育出版社下载本文