宁德职业技术学院

毕业设计论文

题   目： 啤酒中双乙酰的检测及检测干扰因素的研究  

作    者：   梁 华 英    学  号：  **********    

班    级：             07 农  检                  

系    别：          农 业 科 学 系              

专    业：          农产品质量检测              

指导教师：  田 妍 基   专业技术职务   讲 师      

 2010 年 6 月  福建福安

毕 业 论 文 中 文 摘 要

啤酒中双乙酰的含量是啤酒质量评价中的一项非常重要的指标，通过使用EBC法对不同样品在不同的比色时间、蒸馏水加入量、温度、消泡剂、啤酒新鲜度等件下测定其吸光度，得出不同实验条件对测定结果的影响，以求在实验中掌握好其关键点，确保测定结果的准确性。

关键词：双乙酰  啤酒  吸光度  影响因素

1绪论

双乙酰是啤酒中重要的风味物质，啤酒中双乙酰的含量是啤酒质量评价中的一项非常重要的指标，而且是我国每年质量抽检中，经常抽检的指标之一，因此对啤酒中双乙酰含量的测定方法和检测干扰因素进行研究是非常重要的。通过实验力求在实验中掌握好其关键点，确保测定结果的准确性。

早在1971年国际营养学会就将啤酒列为营养食品，人们常称啤酒为“液体面包”。啤酒是一种低醇饮料，富含蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质等营养成分。啤酒中的联二酮对啤酒风味影响很大，联二酮是双乙酰与2，3-戊二酮的总称。两者化学性质相似，赋予啤酒生青味，使啤酒产生不成熟、不协调的口味和气味。但2，3-戊二酮在啤酒中的含量比双乙酰低的多，其口味阈值约为2mg/L，是双乙酰口味阈值的10倍，所以对啤酒风味影响不大，其起主要作用的仍是双乙酰。正确的检测结果对于提高啤酒质量和工艺的调整具有非常大的作用。

双乙酰是风味物质中重要的一种，是品评啤酒成熟与否的主要依据。啤酒中双乙酰含量测定方法有多种：包括EBC法、改进EBC法、新EBC法、荧光分析法、脉冲极谱法、气相色谱法等，目前国标GB/T4928—2008中使用的EBC法在控制啤酒产品质量方面起到重要作用。但在测定过程中往往会因为控制不好时间、温度等因素而使测定结果不准确，使啤酒等级变低或不合格[1]。

1.1双乙酰的性质

化学式：

分子式：CH3COCOCH3

性质： CH3COCOCH3 又称丁二酮。存在于茴香油和奶油中。黄色油状液体，稀溶液有奶油气味。相对密度0.990，沸点88～91℃。双乙酰是酿酒行业的工艺术语。一种影响酒类风味的物质,是发酵过程中酵母和细菌的代谢产物。它在白酒中是白酒香味成分之一,而在啤酒中双乙酰及其前驱体(α-乙酰乳酸)的含量超过口味阈值(0.2mg/L),就会使啤酒具有一种馊饭味,不适饮用,这是一种较为普遍的啤酒口味质量问题。

1.2双乙酰对啤酒风味的影响

造成啤酒风味不成熟的原因不是由于缺少某些物质，而是由于在主酵期间，酵母产生影响啤酒风味的某些代谢产物没有排放到人们能够接受的程度。在众多影响啤酒风味成熟的物质当中，双乙酰是关键，其被认为是衡量啤酒成熟与否的决定指标。优质啤酒的双乙酰含量应控制在0.1mg/L以下。

1.3双乙酰的产生及其还原途径

双乙酰的产生途径主要有四点:

①由乙酰辅酶A与羟乙基硫胺素的焦磷酸盐（又称活性乙醛）直接缩合，进一步释放出辅酶A，形成双乙酰[2]。

②酵母活性较差，出现酵母细胞自溶后，其体内的α-乙酰乳酸溶解在酒液中，经氧化脱羧会形成双乙酰[3]。

③生产过程中污染了某些厌氧菌(主要是链球菌和乳酸杆菌等)，能够迅速繁殖同时生成α-乙酰乳酸和双乙酰，α-乙酰乳酸经氧化脱羧形成双乙酰[4]。

④由α-乙酰乳酸非酶脱羧氧化而成，此为生成双乙酰的主要途径。双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸是酵母合成缬氨酸的中间产物，当酵母生产繁殖，需要大量合成缬氨酸时，丙酮酸被大量转化为α-乙酰乳酸，但由于乙酰羟基同分异构还原酶（RI）效率很低，因此，使双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸得以积累。酵母细胞内的α-乙酰乳酸不会直接转化为双乙酰，必须被酵母排出细胞外(发酵液中)，经非酶氧化脱羧形成双乙酰。

发酵液中的双乙酰再依靠双乙酰渗透酶输送入酵母细胞中，在细胞内将双乙酰还原成2，3-丁二醇，然后再排出酵母细胞外[5]，此为双乙酰的还原途径。

如在发酵液中加α-乙酰乳酸脱羧酶，可直接将双乙酰的前体物质α-乙酰乳酸催化分解，还原成乙偶姻。从而避免和减少了双乙酰的生成，可大大缩短双乙酰的还原时间。

1.4加工过程中双乙酰的控制[6]

控制双乙酰主要是对双乙酰在主酵生成、后酵还原及滤酒、包装过程的影响因素进行分析控制，使双乙酰的含量降低到合理的水平。

此外，研究结果表明，α-乙酰乳酸形成数量的多少取决于酵母对缬氨酸的需求量及麦汁中缬氨酸的含量。麦汁中的缬氨酸含量多时，酵母合成缬氨酸的量就会减少。可抑制α-乙酰乳酸的生成。最终抑制双乙酰的生成。

2双乙酰的检测方法及其检测干扰因素

2.1双乙酰的检测方法[7][8]

2.1.1原理

用蒸汽将双乙酰蒸馏出来，与邻苯二胺反应，生成2，3-二甲基喹喔啉，其反应式为：

双乙酰+邻苯二胺→2，3-二甲基喹喔啉+水

在波长335nm下测量其吸光度。

2.1.2仪器设备及试剂

2.1.2.1仪器设备

带有加热套管的双乙酰蒸馏装置，分析天平（型号HM202），紫外分光光度计（型号UV2102PC），恒温循环水浴（型号F12MB），2000W电炉（上海日用电炉厂双层铁皮电炉），30～40cm蛇型冷凝管，3000ml圆底烧瓶，10ml单标线（大肚）吸管，0.5ml刻度吸管，5ml刻度吸管，100ml量筒，25ml容量瓶，10ml容量瓶,25ml比色管，10mm石英比色管，止水夹，吸耳球

2.1.2.2试剂

盐酸溶液（4mol/L）：取36ml浓盐酸，用蒸馏水定容至100ml，存放于试剂瓶中，保质期为3个月。

邻苯二胺溶液（10g/L）：称取邻苯二胺0.100g，溶于4mol/L盐酸溶液中，并定容至10mL，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制与使用；若配制出来的溶液呈红色，应重新更换新试剂；

有机硅胶消泡剂（或甘油聚醚）；

冷凝水：可使用自来水，如自来水温度＞20℃，应使用恒温循环水浴。

2.1.3样品制备

放入冰箱或水浴中，0～5℃进行测试

冷贮酒样品需用双层中速滤纸过滤；清酒、成品酒无需。

2.1.4设备安装

1.烧瓶排气口 2.蒸馏器废液排放口 3.冷凝管样品馏出口 4.连接管 5.进样口 6.冷凝管进水口

7.冷凝管出水口 8.烧瓶瓶口

将烧瓶置于2000W电炉上，于瓶塞处8打孔，插入一玻璃管，玻璃管与蒸馏器进气口连接管4相连，蒸汽瓶右侧瓶塞打孔插入玻璃管于乳胶管相连为排气口1。连接自来水至冷凝管的进水口6，出水口7连接至下水道，如使用恒温循环水浴，直接连接至水浴进、出水口。蒸馏器顶端弯管与冷凝器磨口端相连，确认无漏气。冷凝管应尽量保持垂直，与桌面仰角＞60°，确保样品馏出液的出口3管路长度能够达到容量瓶底部。

2.1.5测定步骤

2.1.5.1分析步骤

将双乙酰蒸馏装置安装好，加热蒸汽发生器至沸，使水沸腾。通气预热后，置25ml容量瓶于冷凝器出口接收馏出液﹙冷凝管出水口温度不得超过20℃﹚，外加冰水浴冷却。加1～2滴消泡剂于100ml量筒中，再注入未经除气预先冷却至0～5℃的酒样100ml，迅速转移至已预热的蒸馏器内，并用少量的蒸馏水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水封口（蒸馏器顶端弯管与冷凝器磨口端相连处），进行蒸馏，直至流出液接近25ml﹙蒸馏须在3分钟内完成﹚时取下容量瓶，复温至20±5℃，用重蒸水定容，摇匀。

2.1.5.2显色与测量

分别吸出馏出液10.0ml于两只干燥的比色管中，并于第一只中加入邻苯二胺溶液0.5ml，第二支不加（做空白），充分摇匀后同时放入暗处放置20～30分钟﹙暗反应时环境温度：20±5℃﹚，然后于第一支管中加入2.0ml盐酸溶液，第二支管中加入2.5ml盐酸溶液，混匀后用10mm﹙或20mm﹚的石英比色皿于波长335nm下，以空白做参比，测定其吸光度﹙比色操作时需盖上比色皿的盖子，比色需在20分钟内完成﹚。

2.1.5.3结果计算

X=（A335- B335 ）×2.4

式中：X—双乙酰含量，mg/L。

A335—在335nm波长下，用10nm比色皿测得吸光度。

B335—比色皿差值。比色皿校准：使用石英比色皿，在两个比色皿中加入重蒸馏水，在波长335nm检测吸光度（即为比色皿差值），吸光度应在±0.002范围内。每次检测前对比色皿进行校准，如超出标准应及时对比色皿进行清洗或更换。

2.4—吸光度与双乙酰含量的换算系数。若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.4。

2.1.5.3检测结果保留三位

2.2双乙酰的检测干扰因素

目前双乙酰普遍采用的检测方法是国标GB/T4928—2008中的EBC法，但在检测过程中易受温度、蒸馏水加入量、比色时间、啤酒新鲜度、消泡剂等因素的影响，双乙酰的检测指标一般作为啤酒质量控制的一个关键控制点，双乙酰是啤酒成熟的性指标。

3实验设计与结果

3.1温度

将4瓶不同发酵罐的冷贮酒样品分别在 5个温度下 2℃、5℃、10℃、15℃、20℃进行蒸馏，其他条件按照上述操作步骤进行测定，测其吸光度，每组进行3次平行测定，取平均值，结果见图1。                                                                     

图1啤酒温度对吸光度的影响

由图1可知，冷藏后的啤酒样品低温测定吸光度较低，吸光度随温度的升高而升高。由此看出样品温度对吸光度的测定值影响较大，所以啤酒经过冷藏（0～5℃）预处理后，准确度才能得到保证。

3.2蒸馏水加入量 

将4瓶不同发酵罐的冷贮酒样品迅速转移至已预热的蒸馏器内，分别用0ml、5ml、10ml、20ml、30ml、50ml蒸馏水冲洗带塞漏斗进行蒸馏比色测定，每组进行3次平行测定，取平均值，结果见图2。

图2 蒸馏水加入量对吸光度的影响

由图2可知，不加蒸馏水与加入过多蒸馏水冲洗带塞漏斗进行蒸馏比色测定，吸光度值偏低。由此看出加入蒸馏水的量对吸光度的测定值有影响，要得到正确的检测结果，加入冲洗带塞漏斗的蒸馏水量必须控制在5～10ml为宜。

3.3比色时间

将4瓶成品酒样经预冷至2～5℃后进行蒸馏，置备好的样品溶液放于暗处反应加入盐酸后立即比色，记录数据。然后再隔20min、40 min比色测定，每组进行3次平行测定，取平均值，结果见图3。啤酒在开口后和在比色结束后分别进行感官检验，结果见表1。

图3 比色时间对吸光度的影响

表1 啤酒比色前后感官评定

3.4啤酒新鲜度

将4瓶成品酒样开瓶后立即进行蒸馏和开瓶后的样品敞口放置10min后进行蒸馏比色测定，每组进行3次平行测定，取平均值，结果见图4。

图4 啤酒新鲜度对吸光度的影响

由图4可知，啤酒放置一段时间后，其吸光度增大，可能是啤酒中残留较多α-乙酰乳酸，经开口放置后，α-乙酰乳酸被氧化，其双乙酰含量有所增加，并产生不愉快气味，测定值偏大，但这并不代表啤酒本身的双乙酰值超过标准，所以啤酒开瓶后应立即进行测量，才能保证测定结果的准确性。

3.5消泡剂

3.5.1消泡剂加入量

同一样品滴加不同数量的消泡剂对测定结果的影响如表2

表2 消泡剂加入量对吸光度的影响

    消泡剂量

从表2看出：①蒸馏水不加消泡剂，蒸馏比色后其吸光度为0，相应双乙酰计算值为0；②蒸馏水样随着消泡剂加量的增加，蒸馏比色后其吸光度逐渐增大，相应双乙酰计算值也逐渐增大；③同一酒样随着消泡剂量的增加，蒸馏比色后其吸光度逐渐增大，相应双乙酰计算值也逐渐增大。因此，加入1～2滴消泡剂为宜。

3.5.2消泡剂加入型号

同一样品加相同数量但品种不同的消泡剂对应双乙酰检测结果如表3

表3 消泡剂加入型号对吸光度的影响

消泡剂量

表2、表3说明：消泡剂中的某些成份经蒸馏后，与邻苯二胺也会反应，从而影响检测结果。消泡剂对双乙酰检测值有较大的影响，加入量越大影响越大，而不同的消泡剂对双乙酰检测结果的影响不同，无色透明的有机硅消泡剂比乳白色不透明的非有机硅消泡剂对双乙酰的检测结果影响小，实验室一般使用无色透明有机硅消泡剂。

4其它因素对测定结果的影响[9]

4.1显色剂

显色剂邻苯二胺是显色反应的关键，此试剂一定要在暗处保存，且不能超期存放，否则，试剂的颜色会变得发黄、发黑，配制出的标准试剂会带有颜色，使测定结果偏高。所以配制此药时一定要精心，且当天配制，当天使用。 

4.2显色温度

显色反应速度与温度有关。实验表明，随着显色温度升高，反应速度加快，其颜色逐步加深，吸光度增加，会使测定结果偏高；温度过低，反应不充分，则会使测定结果偏低。这可能同参与显色的物质成份有关。由于不同的环境、不同的季节温度悬殊较大，所以测定结果会有误差。但国标中未对测定时的显色温度作出规定，建议显色温度统一控制在20℃（或25℃）。

4.3蒸馏时间

蒸馏时间不同，测定结果也不相同。同一样品随蒸馏时间的延长，测定结果也随之升高。这与样品中存在联二酮类的前驱物质（α-乙酰乳酸）有关。因为当温度高时，α-乙酰乳酸的非酶氧化速度很快，时间不同，它的转化率也不相同。标准中虽规定蒸馏时间为3～5分钟，但由于电炉功率大小、冷却效果的好坏存在差异，使实际蒸馏时间发生波动，造成了前驱物质存在数量不等的转化。 因此蒸馏时间应严格把关。

4.4比色皿

双乙酰的测定选用波长为335nm，属紫外光源，按仪器使用说明书，在此波长下进行比色一定要使用石英比色皿，若使用玻璃比色皿会使测定结果偏高。国标中未对比色皿的材质做出明确规定，一些化验室使用玻璃比色皿造成一定的误差。

4.5电炉、冷凝器的使用规格 

在实际蒸馏操作过程中，使用2000W的电炉功率大，因此，对凝器装置要求会更高。否则会由于电炉功率过大，而冷凝效果又不好，使双乙酰在蒸馏过程中有挥发，影响结果的准确性，并且存在安全隐患。

结 论

比色时间、蒸馏水加入量、样品温度、样品新鲜度、及消泡剂的使用对双乙酰含量测定的准确性有较大影响。在测定双乙酰吸光度时，其测定值随比色时间的延长而增大，测定值偏大；不加蒸馏水或加入量过多使双乙酰的吸光度测定值均偏低；双乙酰的吸光度随样品温度升高而增大，测定值偏大；啤酒新鲜度随着时间的延长而变小，其双乙酰值增大，所测结果也偏大；检测过程中其它条件都控制一致的情况下，双乙酰检测值随消泡剂加入量的增加而增加，不同类型的消泡剂对双乙酰检测值影响不同，透明的有机硅消泡剂比乳白色不透明的非有机硅消泡剂对双乙酰的检测结果影响小。因此，在不同的实验条件下，所测得的双乙酰吸光度不同，即测得双乙酰含量不同，但同一样品在同样条件下其双乙酰含量并没有发生超出允许范围的变化。所以测定时样品应先经过冷藏预处理，使温度控制在0～5℃，且加入少量的蒸馏水冲洗带塞漏斗进行蒸馏；在测定时，加入盐酸后应立即比色或在20min内比色，得出正确的检测结果，啤酒开瓶后应立即进行测量，才能保证测定结果的准确性，测成品酒或发酵液中双乙酰时建议用无色透明的有机硅消泡剂，且尽量少加，每次新采购的消泡剂，首次使用时以蒸馏水加消泡剂蒸馏比色，以确定该消泡剂对检测结果有多大的影响，在检测啤酒双乙酰时，剔除消泡剂的影响。

最后，仪器使用要正确，操作要准确熟练。尽量减少各种操作误差，保证双乙酰测定的准确度。

致 谢

在本次论文撰写过程中，田妍基老师对该论文从选题，构思到最后定稿的各个环节给予细心指引与教导,使我得以最终完成毕业论文撰写。田老师治学态度严谨，为人和蔼，并且在整个毕业撰写过程中，细心指引与教导,使得我的毕业论文课题能够深入地进行下去，也使我接触到了许多理论和实际上的新问题，使我做了许多有益的思考。在此表示诚挚的感谢和由衷的敬意。

在此，我要感谢在这两年多来关心、帮助过我的老师、同学、朋友们，让我感受到这个大家庭的温暖，使我不断的成长。感谢宁德职业技术学院的各位领导对我的关心和帮助。

最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅、评议和参与本人论文答辩的专家老师们。

参考文献

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[3]蒋旎.啤酒中双乙酰的还原[J].成都纺织高等专科学校学报，2007，3(4):2.

[4]孙美玲.啤酒中双乙酰成分的形成与控制[J].酿酒 2007，23(4):23-24.

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[6]李绒.啤酒生产过程中双乙酰的控制[J].酿酒，2002，36(2)：36-37.

[7]GB/T4928-2008,啤酒分析方法[s].

[8]GB4927-2008,啤酒[s].

[9]左永泉.关于GB4928-91中双乙酰实验方法的探讨[J].轻工标准与质量，2000 (1):29-30.下载本文