一，原 理
1、考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为亮兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合.
2、蛋白质-染料复合物在595nm下测定的吸光度与蛋白质的浓度成正比.
二，Bradford法优点
1)灵敏度高
其最低检测蛋白质含量可达1ug/mL,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化要比其它方法大得多。
2)测定快速、简洁
只需要加一种试剂；完成一个样品的测定,只需要5分钟左右 。
染料与蛋白质结合的过程大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间颜色的稳定性最好。
3)干扰物质少
一些阳离子如K+、Mg2+、Na+和硫酸铵等不干扰测定。
干扰物质：去污剂 SDS、TritonX-100
三，Bradford法缺点
(1)由于各种蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差 .
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等.
(3)标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算，只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.
四，试剂与器材
1.试剂
(1)标准蛋白质溶液,用牛血清蛋白配制成0.1mg/ml。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1L后过滤使用。
2.器材
(1)可见光分光光度计
(2)试管
3，操作
| 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 |
| 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (0.1mg/ml) 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 考马斯亮蓝 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 |
五，注意
1、测量时从低浓度开始测量。这样可以不用润洗这个操作。
2、操作完成后，比色皿一定先用水洗，然后用乙醇洗，再用水洗净。
六，思考
1、在实验中，使用的水一定是蒸馏水吗？ 为什么？
2、考马氏亮蓝G-250和R-250的区别。下载本文
