干旱、营养缺乏、氧化应激等等的影响。作为一种自我保护机制，植物会在受伤部位产生一类特殊的次级代谢产物，即植物抗毒素（phytoalexins ）以抵御外部环境的侵袭。研究发现一些植物抗毒素具有多种生物活性。在结构复杂的植物抗毒素中，由大豆异黄
酮（isoflavones ）衍生出的一类异戊烯黄酮（glyceollin ）在近些年引起了一些学者的关注。一些研究团队特别是美国农业部的Cleveland 对异戊烯黄酮的功能性研究做了大量的工作[1-2]，研究发现异戊烯黄酮具有多种生理活性，特别是与大豆异黄酮及异戊烯黄酮的前体大豆甙（daidzein ）相比具有更明显的雌激素作用和抗癌作用，尤其对女性更年期症状的改善和对一些癌细胞如乳腺癌细胞的抑制作用比较明显。
采用主成分分析真菌应激大豆的代谢组学研究
冯升同1，冯声宝2，欧阳荣1
（1．北京石油化工学院数理系，北京102617；2．新加坡国立大学化学系，新加坡117543）
摘要：真菌应激后的大豆会产生具有一定保健功效的植物抗毒素异戊烯黄酮（glyceollins ），可利用此真菌应激后的大豆开发出新的功能食品。但与此同时，真菌应激后的大豆还会产生大量的微量次级代谢产物，有些为功效成分，有些可能为有害成分，要全部鉴定这些微量成分的结构、代谢途径、产生机理，功能以及安全性是非常困难的。利用代谢组学方法研究真菌应激后的大豆次级代谢产物，对获取的大量数据进行数学预处理，包括调相、基线校正以及归一化。
对预处理后的数据进行主成分分析，比较标准化和未标准化的2种结果。采用得分图对样本进行分类，采用负载图分析不同样本之间的差异，分析“真菌应激”以及“应激天数”对大豆次级代谢产物产生的影响过程，能够有针对性地研究具有主要影响作用的微量次级代谢产物，为真菌应激后的大豆深加工质量控制、营养、功能和安全研究提供参考。关键词：主成分分析法；大豆；真菌应激；代谢组学；核磁共振
Metabonomics Study of Fungal Stressed Soybeans with Principle Component Analysis
FENG Sheng-tong 1，FENG Sheng-bao 2，OUYANG Rong 1
（1．Department of Mathematics and Physics ，Beijing Institute of Petro－chemical Technology ，Beijing 102617，China ；
2．Department of Chemistry ，National University of Singapore ，Singapore 117543，Singapore ）
Abstract ：Fungal stress on soybeans can produce a group of phytoalexins ，named glyceollins．Thus the stressed soybeans can be developed as novel functional foods．Meanwhile ，fungal stress on soybeans can lead to generation of enormous secondary metabolites with unknown structures and properties．Some of the metabolite may possess health benefits ，while others may be harmful to the human．However ，it 's almost impossible to identify all the metabolite structures ，
learn their metabolism pathways and the functional properties．This study utilized metabonomics to study the fungal stressed soybeans and subsequently used the Principle Component Analysis （PCA
）method to process the metabonomics data．Firstly the data is processed by phase modulation ，baseline correction and normalization．Two results is compared when the data is standardized and not standardized．The samples are classified by score plot and the differences are identified by load plot．The effects of `fungal stress 'and `stressed days 'on soybeans is compared．The key metabolites can be confirmed ，which can be important indicators to control the quality ，nutrition and safety of fungal stressed soybeans．Key words ：principal component analysis ；soybean ；fungal stress ；metabonomics ；NMR
作者简介：冯升同（1972—），男（汉），实验师，硕士，主要从事光信息处理及数据分析处理等。
生物工程
食品研究与开发
F ood Research And Development
2011年10月第32卷第10期
143
根据植物抗毒素的产生机制，人体在日常食用的豆制品中无法补充到异戊烯黄酮，这是由于作为一种植物抗毒素，异戊烯黄酮只有在大豆生长过程中受到外部应激时才会产生。新加坡国立大学的冯声宝等利用食用级真菌Rhizopus Oligosporus应激黑豆产生了0.953mg/g的异戊烯黄酮,并将此大豆应用于豆酸奶的开发[3]。
实际上，由于微生物对大豆的应激过程是一个极其复杂的代谢过程，真菌应激大豆不但会产生上述异戊烯黄酮等功能成分，还会产生大量结构未知的微量次级代谢产物，有些次级代谢产物对大豆的功能、安全、口感、稳定性等具有指标作用，而有些代谢产物由于其含量极低，对大豆的品质没有明显的影响。而利用常规的化学结构鉴定手段对这些微量成分进行结构解析，进而研究其代谢途径、产生机理，功能以及安全性等是非常困难的。通过代谢组学方法（Metabonomics）研究真菌应激后的大豆次级代谢产物，对获取的大量数据进行数学预处理后，应用各种统计学方法，如主成分分析法（Principal Component Analysis），可以筛选出大豆次级代谢产物中对大豆的功能，安全，口感，稳定性等具有主要影响的代谢产物，同时剔除大量无用的次级代谢产物信息。
代谢组学作为一门新发展的技术，通常运用核磁共振（NMR）、质谱（MS）、气质联用技术（GC/MS）、高效液相色谱（HPLC）等先进的分析技术，通过对细胞提取物、组织物和生物体液随时间改变的代谢物进行检测，结合有效的模式识别方法进行确定、定量和分类，并将这些代谢信息和病理生理过程中生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程[4]。
作为众多化学分析方法中的一种，NMR在代谢组学的研究中起着非常重要的作用，这是由于它具有灵敏性、无损性并且能够根据特征峰定性探测代谢物成分等优点。自基于NMR的代谢组学提出以来，引起了各国科学家的极大兴趣，该方法已广泛应用于各个领域，如疾病诊断、药物开发、植物代谢组学、营养科学与微生物代谢组学等方面的研究[5]。
基于NMR的代谢组学研究方法建立起来以后，如何利用数学方法，对获取的海量数据进行处理，最终获取有用信息成为评价这一方法的关键[6]。目前基于代谢组学的数据处理方法有多种，本文将利用主成分分析法对多个样本的代谢组学数据进行对比分析，筛选出真菌应激后的大豆中主要次级代谢产物，为未来的次级代谢产物结构鉴定，特别是为真菌应激后的大豆深加工的质量控制、营养、功能和安全评价提供依据。
1样品制备与处理
1.1真菌应激黑豆的处理
根据冯声宝等提供的方法在无菌操作台中先用70%的乙醇对适量的黑豆表皮消毒3min，然后马上用无菌水洗涤3次，再将黑豆在灭菌水中浸泡10h。浸泡结束后取出黑豆，沥干，取适量作为空白对照样（Control）。将食用级真菌Rhizopous Oligosporus直投菌粉粉末，用灭菌水适量稀释后，与黑豆在无菌容器中充分混匀（接种量0.5%，质量比）。接种后的大豆置于25℃的恒温培养箱中避光发芽。每24小时（1d），48小时（2d），72小时（3d）后分别取真菌应激的黑豆进行样品处理，分别标记为1d GR，2d GR和3d GR（此处“G”和“R”分别代表“发芽”和“真菌应激”，下同）。与上述黑豆发芽处理方法相似，将浸泡后但没有接种Rhizopous Oligosporus的黑豆直接放置于无菌容器中，然后置于25℃的恒温培养箱中避光发芽。每24小时（1d），48小时（2d），72小时（3d）后分别取适量未经真菌应激的黑豆进行样品处理，分别标记为1d G No R，2d G NoR和3d G NoR（此处“NoR”代表“未经真菌应激”，下同）。
1.2黑豆样品处理与核磁共振（NMR）分析
将上述样品Control，1d GR，2d GR，3d GR，1d G NoR，2d G NoR和3d G NoR分别加适量的去离子水后粉碎，然后进行冷冻干燥，得到的冷冻干粉于-20℃储存备用。准确称取干粉50mg，与0.75mL氯仿-甲醇混合冷冻液（1∶2，体积比）及50mL冰水混合。将该混合液充分振荡30s，然后置于冰水中静置3min。将上述操作重复3次。然后将0.3mL冰水和0.25mL氯仿冷冻液加入混合液中。充分混匀后再振荡30s，然后将混合液置于冰水中静置1min。将上述操作再重复3次。然后将混合液在高速离心机中以11000r/min的转速离心3min。吸取离心后的混合液下层有机溶液于eppendorf管中，用氮气吹干后，置于真空干燥箱中，在常温下抽真空干燥24h，然后用1mL氘代氯仿溶解后，转移至核磁共振（NMR）样品管中，在AC300型Bruker核磁共振仪中分析，得到核磁共振图谱以及图谱数据。
2样本原始数据预处理与主成分分析
2.1真菌应激后的NMR图谱及原始数据预处理
本文研究的真菌应激黑豆共有7组样品，每组样品有2个重复样本，每个样本经核磁共振仪平行测定3次，共得到14个NMR图谱及14组原始数据，分别是对照样本Control-1和Control-2（简称为“c1”和“c2”），经过黑豆发芽及真菌应激1d后的样本1d GR-1和1d
生物工程
144
GR-2（简称为“1r1”和“1r2”），经过黑豆发芽及真菌应激2d 和3d 后的样本2d GR-1、
2d GR-2以及3d GR -1、3d GR-2（简称为“2r1”、“2r2”、“3r1”、和“3r2”）；大豆经过发芽但没有真菌应激的样本数据1d G NoR-1、1d G NoR-2，2d G NoR-1、2d GNoR-2以及3d G NoR-1、3d G NoR-2（简称为“1nr1”、“1nr2”、“2nr1”、“2nr2”、“3nr1”和“3nr2”）。经核磁共振仪分析后，得到每个样本的NMR 图谱，
NMR 图谱中的每一个峰均代表了某种化学基团，而几组峰的组合即组成了黑豆中某种化学成分的结构，这种化学成分可能为黑豆本身含有，也可能为新产生的某种次级代谢产物。通过与对照品的NMR 图谱进行比较，样本的NMR 图谱中各种峰的增减，峰面积的变化即说明了某些化学成分含量的增加，减少或者新次级代谢产物的产生。为便于讨论，本文任取1个样本，如1nr1，经核磁共振仪分析后，得到其NMR 图谱（图1），该图谱的横坐标为化学位移值（Chemical shift
），纵坐标为响应值（Intensity ）。然后每间隔化学位移值（Chemical shift ）0.0005从NMR 图谱曲线中读取每个点的坐标，得到该图谱的原始数据共32768组（表1，仅列出部分原始数据）
。由此可以看出，一个样本的NMR 原始数据量已经非常巨大，要从这么巨量的数据中筛选出对样本具有指标作用的次级代谢产物是非常困难的，而要对多个样本进行分类比较，并找出不同样本间的差异变得更加困难，因此必须对这些原始数据进行预处理，包括调相和基线校正，剔除没有明显峰形的基线数据和噪音，筛选出有用的信息再进行比较。
以图1和表1为例，化学位移在7.80~15.90之间的响应值均处于基线附近，没有明显的峰形出现，因此位于这些区间的数据可以全部剔除。
同样，化学位移在-2.077~0.212之间的响应值也处于基线附近，没有明显的峰形出现，因此位于这些区间的数据也可以全部剔除。最后筛选出有效数据共102列，然后对其进行归一化。其余13个样本的NMR 图谱和数据的预处理方法均采用上述同样的处理步骤，最后得到14组各102列数
据（表2，仅列出部分数据）。2.2应用主成分分析法（PCA ）对归一化后的黑豆样本数据分析
2.2.1
主成分分析法简介
主成分分析法（principal component analysis ）是一种在保持数据信息损失最少的原则下，对高维变量进行降维处理的线性映射方法。它的基本算法是要找到
一种空间变换方式，把经预处理后的原始变量线性组合成若干个相互正交的矢量（即主成分，PC ）。通常情况下，第一主成分能反映样本间的最大差异，其他主成分反映的差异程度依次降低。其原理如下：
设X 是经过预处理后含有m 个变量n 个样本的样本集，第k 个主成分矢量（也称为主成分负载loading ）为：
P K =（p 1K ，p 2K ，…，p NK ）T
，k=1，2，…，m
（1）
P 是主成分矢量矩阵，即X 的协方差的特征矢量。X 在P 上的投影为样本的主成分（也称为主成分得分score ）
矩阵：
图1样本1nr1的核磁共振（NMR ）图谱
Fig.1The NMR spectra of the sample `1nr1'
表11nr1核磁共振（NMR ）图谱的原始数据表
Table 1The raw NMR data of `1nr1'
数据序列
1234567101112131415 (3275732758327593276032761327623276332732765327663276732768)
化学位移值/ppm
15.90015.90015.915.915.815.815.715.615.615.515.515.415.415.315.3………-2.071-2.072-2.072-2.073-2.073-2.074-2.074-2.075-2.075-2.076-2.077-2.077
响应值I 8117298034568050957995157967537924917911337800776798773849765997765467763030767134756131 (142674143073141007140883149681149317158636156017151723157311161551160185)
生物工程
冯升同，等：采用主成分分析真菌应激大豆的代谢组学研究
145
图2未标准化得到的14组数据的的得分图
Fig.2PC scoring plot of the fourteen samples when not
standardized
T =XP
（2）以主成分矢量为坐标轴作图（称为得分图），可以反映类别间的差异，及其随时间的变化轨迹；与之对应的主成分负载图能够反映导致类别差异的主要元素。2.2.2
应用主成分分析法（PCA ）对归一化后的黑豆样本进行数据分析
由于PCA 操作的简便和变量的可解释性，使它成为代谢组学研究的常用方法。对于由NMR 图谱数据组成的样本，其元素是化学位移区间。因此，只要知道因其类别间差异的NMR 谱区域，
就可能得到此区域内的化合物及其含量的变化，这些化合物可以作为类别差异的标志物。数据列表见表2。
表214个黑豆样本的NMR 图谱数据经归一化后的数据列表Table 2The normalized NMR data of the fourteen black beans
数据序列化学位移值ppm Control -1Control-21d GR-11d GR-22d GR-12d GR-23d GR-13d GR-21d GNoR-11d G NoR-22d G NoR-12d GNoR-23d G NoR-13d G NoR-2
17.2150.7423740.2733950.3628310.2707410.6625840.3056180.5070180.2975350.0722030.0662140.166140.1046730.4901940.187723
25.330.2037810.12550.1836540.1581910.1830060.0888190.118050.1276290.1498380.2143020.1670590.1459560.1788160.160824
35.3160.5438530.4848370.4514980.4507570.4070420.2904520.2874270.291090.4565710.5054020.4337010.4034080.4457050.422338
45.3050.6781690.6387350.5709970.6172810.45960.4012150.3552340.379960.594650.6665550.5405550.5396730.5545760.546232
……………………………………………………………………………………
980.8175.4040814.26375.6108623.9600654.02634.04778.1784113.8678774.3691734.078124.2175413.8611434.2925613.794493
990.8063.9601723.3079173.377743.2819554.141363.83242.5621424.16723.3508673.2778353.3519323.2174533.3923763.088079
1000.7921.6915991.4419111.5119971.4462741.8834721.7452012.1688422.051451.5537121.4043541.5437011.45191.5307281.420542
1010.7730.1136850.1045210.1147760.1047950.1307610.1185540.1918530.2162810.1415210.0615310.1312480.1283480.1169370.12596
10200.26660.2077770.1586660.1244770.2542660.2013930.2994290.2450140.2122140.1876580.2930420.2486520.205590.170049
对表2中的14组样本数据，有2个主要影响变量，即“真菌应激与否”和“应激天数”，希望对它们进行分类，分别观察“真菌应激”和“应激天数”对样本的影响，然后在它们能够分类的基础上，找到样本间的最大差异，即找到由于“真菌应激”和“应激天数”的影响而出现最大差异的数据列。
PCA 数据处理通常包括以下几个步骤：图谱处理，如基线校正、去偏置以及分段积分等；生成一个m 行（每行代表一个样本）n 列（每列对应样本的一个变量）的原始数据矩阵；数据归一化（行操作）；数据标准化（列操作）；数据的多元统计分析。其中数据多元统计分析前的4个步骤统称为数据预处理过程。
对该矩阵进行主成分分析，分析比较数据进行标准化和非标准化后的2种情况。主成分分析后，以第一主成分为横轴，第二主成分为纵轴作图，得到数据未标准化的得分图，如图2所示。
从图2看出，第一主成分所占有的份量为PC1=80.4%，基本能够反映样本的最大特征。样品明显地分为3类；c1、c2、1r1、1r2、1nr1、1nr2、2nr1、2nr2属于第1类，2r1、2r2属于第2类，3r1、3r2属于第3类。说明“真菌应激与否”对大豆的次级代谢产物有显著的影响，由于没有“真菌应激”过程，因此1nr 、2nr 、3nr 与c1、c2之间没
有明显的差异，又说明仅发芽的大豆其次级代谢产物没有明显的增加。
而对于进行了“真菌应激”的大豆，随着“应激天数”的增加，反应代谢组学状况的NMR 图谱中的峰形差异也越来越大，说明黑豆次级代谢产物发生了明显的变化，这些变化既可能是产生了新的次级代谢产物，或者由于代谢产物的含量发生了明显的变化。
经过1d 的“真菌应激”，由于真菌正处于缓滞期，生长缓慢，对黑豆的影响很小，因此其代谢产物与对照品或没有经过真菌应激的大豆相似，处于同一区域，而经
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（下转第161页）
图5比较1nr 和3r 得到的负载图
Fig.5PC load plot comparing `1nr'and
`3r'
图4比较1nr 和3r 得到的得分图
Fig.4PC scoring plot comparing `1nr'and
`3r'
图3标准化后得到的14组数据的得分图
Fig.3PC scoring plot of the fourteen samples when standardized
过2d 的真菌应激后，代谢产物的组分和含量已经产生了较明显的变化，因此与上述第一个阶段的样品分开。经过3d 的真菌应激，大豆的代谢产物组分与含量已经发生了明显的变化，与其他2个阶段完全分开。图3是数据标准化后的得分图。
第一主成分所占有的份量PC1=97.4%，能够很好地反映样本的最大特征。由图3可以看出，样品分为2类，3r1、3r2和别的样本区分得很开。这表明，经过数据标准化处理后，该物质成分的差异性更能明显地体现出来。经过比较，其余样本的数据均要求经过标准化处理，以比较“真菌应激”以及“应激天数”的影响。
在上述样品能够分类的基础上，再对样品进行两两比较，找出不同样品间的最大差异，即筛选出具体由哪类物质成分及含量发生了明显的变化。
下面对1nr 和3r 两组样品进行比较，方法同上，分别得到得分图（图4
）和负载图（图5）。从图4看出，第一主成分能够将它们很好地分成两类。从负载图图5可以看出，这两类样本最大的差异表现在56列和57列数据上，56列和57列对应的化学位移
是3.495和3.383，第20，55，46，58列等也显示出了明显的差异，其对应的化学位移分别为4.835，3.507，3.663，3.375。以此类推，我们也可以得到c/1r ，c/2r 、c/3r 、c/1nr 、c/2nr 、c/3nr 、1nr/1r 、1nr/2r 、2nr/1r 、2nr/2r 、2nr/3r 、
3nr/1r 、3nr/2r 和3nr/3r 等不同样本之间的得分图和负载图，并筛选出不同样本之间差异最大的列数及其对应的化学位移。
3基于PCA 分析结果的次级代谢产物结构解析
经过PCA 分析结果，我们得到了不同样本之间差异最大的列数及其对应的化学位移。由此，我们将每个样本32678组数据一共14个样本的巨量数据信息缩减到了不到100组数据信息，
而剩余的几十万组数据均属于无用信息而被剔除掉。根据筛选出的近100组数据的化学位移值及其响应值，结合核磁共振图谱的解析方法，我们可以相应得到不同样本与各自化学位移值对应的次级代谢产物结构。经结构解析，我们分别从真菌应激的黑豆中鉴定出异戊烯黄酮，Oxooctodeca-dienoic 酸等6种不同的次级代谢产物，而这些次级代谢产物仅在真菌应激后的黑豆中产生，而在发芽的大豆中则不会产生。
与此同时，经过3d 的真菌应激和发芽过程，黑豆中的异戊烯黄酮含量会达到最高值。由此可通过对“真菌应激与否”以及“应激天数”2种因素进行人为控制，得到对黑豆的功能、安全、口感、稳定性等产生最佳作用的条件，从而筛选出最优的黑豆处理条件，为下阶段的黑豆深加工提供依据。4结论
真菌应激大豆会产生大量结构未知的次级代谢产物，这些次级代谢产物对真菌应激大豆的营养、口感、功能、安全等也可能具有重要的影响。由于核磁共振技
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（上接第147页）
术（NMR ）具有无损伤性和高重现性，能够对样本的次级代谢产物体系进行快速成分分析，因此利用NMR 获得真菌应激大豆的代谢组学数据，然后对NMR 数据进行图谱处理、
归一化、标准化等预处理后，采用主成分分析法进行分析，能够对不同样本进行快速分类，筛选具有显著差异性的特征次级代谢产物。本文通过寻找出
“真菌应激”和“应激天数”对黑豆次级代谢产物的影响程度，筛选并鉴定出对黑豆具有指标作用的次级代谢产物结构，从而为确定最佳的应激方式和应激时间提供依据，对研究真菌应激大豆的营养、功能和安全等具有重要的指导作用。目前国际上代谢组学的研究日新月异，结合合适的数据处理方法能对代谢组学研究起到事半功倍的作用。而采用何种数据处理方法目前还没有定论，必须结合具体的研究对象进行选择。本文利用主成分分析方法结合核磁共振技术对真菌应激黑豆的次级代谢产物进行主成分分析，能比较准确筛选并鉴定出对黑豆品质影响显著的次级代谢产物，方法简单，快速，因此可成为其他科研人员的参考。
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收稿日期：2011-01-23
2）由于食用明胶呈圆粒状，为了保证结果的准确性，在样品的处理过程中，应将样品进行粉碎、混匀后称取样品；在加热处理时要缓慢升温，以防发生飞溅，导致样品损失。
3）在实验中尽量用白色的玻璃容量瓶，以此可以根据溶液的颜色深浅来判断铬的含量多少，从而调整溶液的稀释倍数，铬含量高溶液呈现橙黄色或黄色。
4）许多专家学者也研究过湿法测定试样中的铬含量，而本法采用了干法处理，因此对这2种方法的对比实验有待于进一步的研究，分析2种方法的区别和联系。参考文献：
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收稿日期：2011-03-27
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质量安全
侯晓东，等：潮州市食用明胶产品中铬含量的调查结果分析
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