摘要    I

Abstract    II

第1章 绪论    1

1.1 土壤污染    1

1.2 土壤污染修复    1

1.3　土壤污染修复中的分子生物学技术    2

1.3.1　基因工程技术    2

1. 3.2　聚合酶链式反应    2

1. 3.3　电泳分离纯化技术    3

第2章 分子生物学技术在重金属污染土壤治理中的应用    5

2.1 分子生物学在汞（Hg）污染土壤治理方面的应用    5

2.2分子生物学在砷（As）污染土壤治理方面的应用    6

第3章 分子生物学技术在石油污染土壤治理中的应用    8

第4章 分子生物学技术在农药和除草剂污染土壤中的应用    10

第5章 总结及展望    11

参考文献    12

摘要

相对水和大气污染等污染类型，土壤污染具有潜伏性、隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，治理难度较大。此外，土壤污染的类型多样，包括农药和除草剂污染、重金属污染和石油污染等，这就进一步加大了土壤修复的难度。而分子生物学技术的发展，使得越来越多的抗污染微生物得以鉴定，越来越多的与微生物降解和转化以及植物超富集有关的基因被发现，并且得到加强。本文分别介绍了分子生物学技术在土壤重金属污染、石油污染和农药与除草剂污染治理方面的应用，重点关注了聚合酶链反应（PCR）、电泳分离、基因工程和16S rDNA序列分析等技术在土壤污染的微生物修复和植物修复领域的应用。

关键词：土壤污染；分子生物学技术；微生物修复；植物修复

Abstract

The pollution of soil is characterized by its latency, hidden nature, long-term property and irreversibility with comparison to water and air pollutions. Furthermore, the diversity of pollutions of soil including pollutions of pesticide, herbicide, heavy metal and petroleum increases the difficulty of the remediation of pollutant soil. However, increasing microorganisms resistant to contaminates were identified with molecular biology technology, and genes of hyper-accumulation in plant and degradation and transformation in microorganisms were found and strengthened. The application of molecular biology technology in the restoration of soil polluted by heavy metal, petroleum and pesticide and herbicide were introduced with the highlight of the using of polymerase chain reaction (PCR), electrophoresis, genetic engineering and analysis of 16S rDNA sequence in the bioremediation and phytoremediation.

Key words: soil contamination, molecular biology technology, phytoremediation, bioremediation

                            第1章 绪论

1.1 土壤污染

由于人类的活动，使得污染物进入土壤并积累到一定程度，引起土壤环境质量恶化，对生物、水体、空气和人体健康造成危害的现象即土壤污染[1]。相对于其它环境介质污染，土壤污染具有隐蔽性或潜伏性、土壤对污染物有富集作用、土壤污染具有长期性和不可逆性、土壤污染后果的严重性等[2]。

造成土壤污染的主要原因包括过量使用化学肥料、过量使用化学农药和除草剂、固体废物的随意堆放和废水灌溉等第[3]。化肥可大幅度的提高农产品的数量和质量，但化肥的过量使用既是资源的浪费，又是造成当前生态环境严重污染的主要原因之一。化学农药和除草剂对提高农业生产力做出了很大的贡献，但在消灭病害虫和杂草的同时，也会使有益于农业的微生物、昆虫和鸟类遭受毒害，同时会使害虫产生抗药性；而且许多化学农药（包括除草剂）属于内分泌干扰素（EDCs），具有环境激素效应，能对人和动物内分泌系统、免疫系统、神经系统产生干扰，从而影响生殖机能，造成雌性化及后代生命力退化[4-5]。矿业、工业固体废物的随意堆放导致附近土壤中某些有毒元素尤其是重金属元素的含量超出一般土壤的含量，这些重金属在环境中不会降解、消失，只能迁移、转化，对环境质量和农产品的品质产生很大的影响[6]，若进入人体内，体内的有关蛋白酶活性受到抑制，或是与体液中的某些离子及蛋白质结合发生沉淀反应，在体内得到聚集浓缩，干扰机体的正常发育，最终导致各种疾病乃至肿瘤的形成。直接使用污染的地表水进行灌溉，会将污水中的有害物质带入农田，改变土质和土壤结构，影响土壤中微生物活动，妨碍植物根系生长，影响作物产量及品质，进而危害到人类健康。

1.2 土壤污染修复

目前用于土壤污染修复的技术包括土壤清洗、离子交换、沉淀固定、微生物修复和植物修复等。近几年，与分子生物学技术相结合的微生物修复和植物修复技术越来越受重视。

土壤生物修复技术是利用土壤中的天然微生物资源或人为添加的目的菌株，甚至是构建的特异降解功能菌株，将滞留的污染物降解和转化成无害的物质，使土壤恢复其天然功能[7]。微生物修复可分为原位生物修复和异位生物修复。原位生物修复是指对受污染的介质(土壤、水体)不作搬运或输送，而在污染地进行的生物修复处理，修复过程主要依赖于被污染地自身微生物的自然降解能力和人为创造的合适降解条件；异位生物修复是指将被污染介质(土壤、水体)搬运和输送到它处进行生物修复处理[8]。

植物修复技术是利用植物对污染物质的吸收、富集和转化能力把土壤中残存的污染物吸收、富集到植物体内，然后收获植物，从而减少土壤中污染物的含量，实现环境修复的目标[9]。重金属污染是土壤环境污染的重要方面，如何消除土壤环境中的重金属污染物已成为国际性难题，而植物修复技术的出现和快速发展为我们展示了一条新的希望之路。

随着分子生物学技术的发展，先进的分子生物学技术越来越多的被引入到土壤污染治理及检测的研究中。越来越多的耐污染微生物得到分离和鉴定，越来越多的修复性蛋白的基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来。通过改造这些基因的结构，采用更强的启动子，并将其转移到受体植物或微生物，可以大幅度地提高植物对重金属污染物的富集速率和最高富集程度，提高微生物降解污染物的能力。

1.3　土壤污染修复中的分子生物学技术[10]

在土壤修复过程中用到的分子生物学技术主要有基因工程技术、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术和电泳分离纯化技术等。

1.3.1　基因工程技术

基因工程是指按照人为创造的蓝图，将某特定的基因，通过载体或其他手段送入受体细胞，通过一系列复杂的生物学过程(类似工程操作)定向改造受体生物，使特定基因在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。用基因工程的方法，可以不受物种亲缘关系的而将一个外源基因导入受体细胞，经过基因重组、增殖并得到表达，产生新的基因产物。基因工程技术在环境污染物处理中的应用主要是应用改良后的工程菌处理污染物，如处理石油污染、降解塑料污染等。

1. 3.2　聚合酶链式反应

聚合酶链式反应技术模仿生物体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开；然后使引物模板退火，二者碱基配对；耐高温的DNA聚合酶即以4种碱基为底物，在引物的引导下合成与模板链互补的DNA新链。PCR技术可在体外快速扩增DNA，具有快速、简便、灵敏度高的特点，能够弥补DNA分子直接杂交技术的不足。PCR技术的产生是整个分子生物学领域的一次重大，发展极快，已衍生出一系列相关的生物技术。污染治理中应用的基于PCR的技术主要有：

（1）反转录PCR技术（RT-PCR）：是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状态的相关性，探测和定量个体结构基因表达。RT-PCR技术可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物，此技术用途广泛且灵敏度高。

（2）竞争PCR（C-PCR）：是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。

（3）AFLP标记，先用酶消化DNA，然后连接上人工合成的双链接头，最后进行PCR和电泳显示。此技术是用一个短的随机引物进行PCR，模板DNA有多个扩增子，可以扩增出多个产物而可能出现多态现象。

（4）扩增的rDNA酶切分析技术（ARDRA），此技术依据原核生物rDNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切，然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性，是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术。

（5）随机扩增多态DNA（RAPD），这是一种基于PCR检测PCR引物结合位点的序列改变的方法。RAPD通常以10 bp的寡核苷酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色扩增产物，再分析多态性。

1. 3.3　电泳分离纯化技术

在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术是当前核酸研究中最常用的方法，具有简单、快速、灵敏、成本低等优点。除了常用的琼脂糖凝胶电泳-溴乙锭染色方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法外，还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记。如单细胞凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳等，都是通过施加不同染色体变性条件改变DNA双螺旋结构。由于不同序列的DNA片段变性时解链程度不同，在凝胶中电泳迁移速率不同，凝胶电泳后不同序列的DNA片段在凝胶上得以高分辨率的分离，可用作各种分子标记物的检测。

（1）单细胞凝胶电泳：包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后，带负电荷的DNA游离断片在电场的作用下向阳极迁移。根据电泳条件，单细胞凝胶电泳可分为中性和碱性单细胞凝胶电泳。单细胞凝胶电泳除可检测DNA单、双链断裂外，还可检测DNA切除修复缺陷和DNA交联、氧化性损伤等多种类型的DNA损伤，是探讨遗传毒性机理的有效工具。

（2）变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）：变性梯度凝胶电泳是依靠变性剂使Tm值不同的分子分离。此技术分辨率高，但需较长的凝胶和电泳时间。在变性梯度凝胶电泳技术应用到分子微生物生态学后，已证明这类电泳技术是揭示自然环境中的生物群体遗传多样性的有效手段，可用于研究污染环境中的生物群落结构及监测环境变化。

（3）温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）：温度梯度凝胶电泳是依靠温度梯度来分离Tm值不同的分子，是使用"热"作为一种能量来源，使得氢键变得热力学不稳定，不同DNA片段由于Tm值不同将表现出不同的解链行为，从而使电泳迁移速率不同，而达到在温度梯度电泳中分离的效果。

第2章 分子生物学技术在重金属污染土壤治理中的应用

重金属通常是指密度大于5.0g/cm3 的元素，元素周期表共有45种。砷（As）、硒（Se）是非金属，但它们的毒性及某些性质与重金属相似，故亦列为重金属污染物。目前环境污染研究方面的重金属主要是一些生物毒性较大元素，如镉（Cd）、铅（Pb）、铬（Cr）、汞（Hg）和 As，此外还包括锌（Zn）、铜（Cu）、钻（Co）、镍（Ni）等植物微量元素等，因为这些元素在高浓度下同样具有较大的生物毒性。

随着工业迅猛发展，大量的重金属严重污染了农田。我国大多数城市近郊土壤都受到了不同程度的重金属污染[11]。重金属可阻碍叶绿素、糖及蛋白质合成，引起光合强度和呼吸强度下降，造成碳水化合物代谢失调及其它一系列生理代谢紊乱，最终导致生长量和产量的下降。土壤重金属可导致土壤微生物群落的变化，呈现出随浓度上升而递减的趋势。而且进入土壤中的重金属对微生物酶活性有很大的影响。

随着重金属污染的加剧，人们对重金属污染治理放方面的研究越来多。在研究的过程中，人们分离出各种耐重金属的微生物，发现了众多超富集植物。近些年，随着PCR、DGGE、基因工程等分子生物学技术的发展，越来越多的乃重金属微生物得到鉴定，越来越多的抗重金属基因被发现和分离。而且利用基因工程等技术，将重金属抗性基因转入特定的微生物或植物体内，可使其获得降解或超富集重金属的能力。下面重点介绍分子生物学技术在治理Hg和As污染土壤方面的应用。

2.1 分子生物学在汞（Hg）污染土壤治理方面的应用

许多微生物体内存在一条转化汞的反应通路，其中有两个关键性的酶：有机汞裂解酶(由merB基因编码)，将有机汞转化为汞离子（Hg2+）；汞离子还原酶(由merA基因编码)，将Hg2+还原为基态汞（Hg0）。Meagher和他的同事对merA基因的序列进行了改造，使之尽可能地符合真核基因的碱基组成，之后将该基因连接到植物启动子上并转入拟南芥。结果发现，该植株对Hg2+的抗性及Hg0的挥发量都明显地高于野生型植株[12]。He等采用叶圆片法将经过人工改造的merA（merApe9）基因导入烟草(Nicotiana tabacum)。结果显示，merApe9基因已整合入烟草染色体中，并且得到了表达。merApe9转基因植物的种子在HgCl2浓度为50μmol/L的培养基上能够发芽，移栽后能正常生长，其中10%~20%的转基因株系抗HgCl2，其种子在HgCl2浓度为350μmol/L的培养基上也能发芽。与merA转基因植物相比，农杆菌介导转化merB得到的转基因烟草对有机汞表现较强的抗性，在水培条件下，有些转基因株系在含2.5 mol/L的醋酸苯汞(phenylmercuric acetate，PMA)营养液里正常生长，而0.1 mol/L的PMA就可以杀死野生型烟草的幼苗[13]。

细菌merA、merB基因在植物中的成功转化并表达以及转双基因植株抗性比转单基因更强的实验结果是基因工程应用实践中的一次重大突破，它们为将细菌中的抗重金属反应通路成功引入植物中提供了很好的模式和借鉴经验。采用相似的方法，将merA、merB基因引入其它植物物种中也已产生汞挥发性植株。转入merA和merB的鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）和印度大麻（Cannabis）均表现出汞抗性的增强[14-17]。对这些转基因植株的植物修复潜在能力的初步实验分析也得到了可喜的结果，与对照植株相比，转merA的烟草修复能力提高了3~4倍，在不到1周的时间内，液体培养基中汞离子浓度由5μmol/L降到了1μmol/L[18]。

2.2分子生物学在砷（As）污染土壤治理方面的应用

Achour等从2个土壤样品中筛选出41个砷抗性菌种并克隆出其亚砷酸盐转运子基因片段，其中70.7%的抗性种包含arsB或ACR3基因。系统发生学分析显示，arsB基因主要出现在硬壁菌门（Firmicutes）和γ-变形菌（Gammaproteobacteria）中，而ACR3则主要出现在放线菌（Actinobacteria）和α-变形菌（Alphaproteobacteria）中[19]。Anderson研究了新西兰2个砷污染场地土壤中的微生物群落并从中分离出了17个抗性种，16S rDNA序列分析发现，它们分属于微小杆菌属（Exiguobacterium）、气单孢菌属（Aeromonas）、绿脓杆菌（Bacillus Pseudomonas）、埃希菌属（Escherichia）和不动杆菌属（Acinetobacter）[20]。Turpeinen等采用磷酸脂肪酸分析(PLFA)法和16S rRNA末端性片段多态性分析(t-RFLP)法研究了砷、铬、铜复合污染土壤中的微生物群落结构，发现微生物多样性降低，群落结构发生改变，一些具有较强抗性的种群如Acinetobacter、爱德华氏菌属（Edwardsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、沙门氏菌（Salmonella）和沙雷氏菌属（Serratia）的数量和活性增强[21]。研究者从沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）中克隆了位于arsRM操纵子上的砷甲基化相关基因arsM，整合到砷敏感的E.coli基因组中，发现ArsM赋予As(Ⅲ)敏感菌株砷抗性。arsM基因编码一个约29656的蛋白质酶腺苷甲硫氨酸甲基转移酶[As（Ⅲ）-S-adenosylmethionine］，可以连续地对As(Ⅲ)进行甲基化，其表达受ArsR编码的阻遏蛋白的[22]。 

Ellis等成功地从蜈蚣草的cDNA文库中克隆出砷酸盐还原酶基因（PvACR2），将该基因超量表达到酵母突变体菌株RM1中，能互补酵母砷酸盐还原酶的功能，恢复突变体菌株RM1对As(V)的抗性。纯化的PvACR2蛋白质表达产物在GSH等协同因子存在的条件下能在体外将As（V）还原成As（III） [23]。Rathinasabapathi等也从蜈蚣草的cDNA文库中克隆了植物磷酸丙糖异构酶 （TPI： triosephosphagte isomerase）的同源基因 （PV4-8）。但超量表达该基因能提高As(V)敏感菌株WC3110对As（V）的抗性，不能提高整个砷抗性操纵子缺失的突变体菌株AW3110对As（V）的抗性[24]。此外，Dong等从蜈蚣草的cDNA文库中克隆了植络素合成酶基因（PvPCS1），该基因编码512个氨基酸，相对分子量为56.9×103。在酵母体内超量表达该基因能提高酵母对镉的抗性[25]。

深入研究蜈蚣草体内砷代谢过程及相关基因和酶的功能，不仅可以提高蜈蚣草吸收和富集砷的能力，而且还可利用基因工程技术来研发比蜈蚣草适用范围更广、栽培更容易、生物量更大的砷超富集植物，从而更好地利用植物修复技术来治理砷污染土壤。例如，在拟南芥体内同时超量表达大肠杆菌的砷酸盐还原酶基因（ArsC）和植络素合成酶基因（γ-ECS），超量表达的植株对砷的抗性提高，在同样含砷的培养基上，转基因植株的生物量是野生型的4~17倍[26]。

第3章 分子生物学技术在石油污染土壤治理中的应用

石油中含有饱和烃、芳香烃、氮硫氧化物及沥青质等都具有毒性，多环芳烃（PAHs）、苯等还具强烈的“三致”（致癌、致畸、致突变）作用。石油进入土壤会影响其正常功能，有害物质还会通过食物链在动植物及人体内富集。随着工业化的日益发展，石油污染逐渐引起人们的重视。石油污染治理过程中，环保、高效的生物修复技术被广泛应用，而微生物由于代谢活性具有一定优势，发展潜力较大。

许多人对石油污染土壤中的生物多样性及其变化进行了研究。吴伟林等采用现代分子生物学技术，从被石油烃污染多年的油泥沙和钻井产生的落地原油新污染土壤中提取细菌总DNA，并对提取的基因组总DNA中16S rDNA V3可变区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）测定。结果表明，年代较久的石油重度污染土壤菌群数量少于轻度污染土壤，经人工堆肥处理的土壤生物多样性明显优于未进行人工处理的污染土壤；经堆肥处理的土壤中微生物多样性在纵向上也存在差异，中层土微生物多样性明显，表层土最不明显；不同污染土壤中存在一定数量相同的优势菌群，但也表现了相当的差异性，经堆肥处理的污染土壤中微生物群落组成的相似性在纵向上也存在差异[27]。

袁婧等从大庆油田受石油污染的土壤中分离得到特征明显的3株石油降解细菌（分别编号为18、H和21），利用PCR技术对其16S rDNA进行扩增，之后对16S rDNA进行了全序列分析，并且综合形态学及生理生化试验获得下表结果[28]。 

表3-1 分子生物学鉴定结果和菌种名称

此外，印度的Mishra等考察了基因重组菌的原油降解效果、存活能力及其稳定性，将编码荧光酶的Lux基因的质粒导入重组菌，尤其关注质粒丢失的情况。试验证明Lux-PCR扩增插入序列是稳定的，在-70℃甘油中保存一年后插入子仍具有稳定性。利用基因工程技术，克隆最初的菲、萘、芴酮降解步骤中的基因，得到多种基因工程菌种[32]。Mills D K等利用Trflp和LH-PCR分子生物学技术监控生物修复中营养对微生物的群落动力学的影响，研究污染物的降解和微生物基础营养物之间的关系[33]。

第4章 分子生物学技术在农药和除草剂污染土壤中的应用

赵璇等对受氯酚污染的土壤中的微生物DNA进行了提取，并利用DGGE分析了微生物的16S rDNA谱带，结果显示：无论是受氯酚污染的土壤样品，还是未受氯酚污染的土壤样品，其微生物种群的16S rDNA的谱带都很复杂；受氯酚污染的土壤样品与未受氯酚污染的土壤样品，其DNA谱带存在明显的差别，表明氯酚对土壤中的微生物种群结构会产生影响。此外，在未受氯酚污染的土壤和受氯酚污染的土壤中，存在一些共同的DNA谱带类型，但其强度有所差别。同时他们还从土壤中富集分离得到对2， 4-二氯酚具有高效降解能力的微生物混合菌群，利用平板划线法从混合微生物菌群中分离出以二氯酚为唯一碳源和能源的纯种微生物。利用16S rDNA序列分析，发现该微生物为红球菌属（Rhodococcus）[34]。

张倩茹等从清洁土壤和长期施用农药的污染土壤中提取得到微生物，并对其16S rDNA片段的DGGE指纹图谱进行分析分析，结果表明清洁土壤和污染土壤的生物区系具有非常明显的差异，其中污染土壤出现了3条特异性带。进一步通过乙草胺、Cu2+单一与复合污染土壤16S rDNA片段DGGE指纹图谱分析则表明，复合污染生态毒理效应在分子水平上更大程度上直接取决于其存在浓度水平的组合关系。在乙草胺-Cu2+复合污染胁迫下，当两者浓度组合为250-300mg/L时，同样产生了3条特异性条带且亮度增强。此外，他们还从污染土壤中筛选出可降解乙草胺的菌株524，其对乙草胺的降解率可达62%。对其16S rDNA进行序列测定，发现它与产酸克雷伯菌属（Klebsiellapneumoniae）的多株菌序列同源性为99%，初步鉴定为产酸克雷伯菌属[35]。

第5章 总结及展望

相对水和大气污染等污染类型，土壤污染具有潜伏性、隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，修复难度较大。此外，土壤污染的类型多样，包括农药和除草剂污染、重金属污染和石油污染等，这就进一步加大了土壤修复的难度。当前，土壤污染修复的方式主要有化学沉淀固定、微生物修复和植物修复等。其中，微生物和植物的数量大、增殖生长快，而且不需要过多的投入，因此微生物修复和植物修复技术越来越受到环境工作者地重视。而且，随着分子生物学技术的发展，越来越多的抗性微生物得以鉴定，越来越多的与微生物降解和转化以及植物超富集有关的基因被发现，并且得到加强。相信分子生物学的进一步发展，定会推动土壤污染修复的进程。

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