二、实验原理

沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法操作简便，成本低廉，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。  

在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作为沉淀剂。

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。

蛋白质在其等电点pH溶液中由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度降低。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。

本实验将根据这个原理，将牛奶的pH调整至酪蛋白的等电点4.7，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去，得到较纯的酪蛋白。酪蛋白在牛奶中的含量比较稳定，利用这一性质可以检测牛奶中是否掺假。

三、仪器与材料

烧杯（250ml、100ml）、玻璃棒、水浴锅、2ml、5ml、10ml移液管、离心机、磁力搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、精密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平等。  

1）盐析实验：饱和硫酸铵溶液、硫酸铵结晶粉末、卵清蛋白溶液500mL（5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液，新鲜鸡蛋清 ：水=1:1 ，然后用六层纱布过滤。）。

2）透析除盐实验：蛋白质的氯化钠溶液：三个除去卵黄的鸡蛋清与700ml水及300ml饱和NaCl溶液混合后，用数层纱布过滤、10%溶液、1%银溶液、10%氢氧化钠、1%硫酸铜。

3）等电点沉淀实验：脱脂或低脂牛奶、滤纸、pH试纸、无水乙醇、乙醚、乙酸钠缓冲液0.2mol/L（pH4.7）[A液:0.2mol/L醋酸钠溶液,称NaAC·3H2O54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取A液1770ml，B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。

四、实验内容

1.球蛋白和卵清蛋白的盐析

1）球蛋白沉淀。加卵清蛋白溶液5ml于离心管中，再加15ml的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解。

2）离心。将上述絮状沉淀液以3000转/分的速度离心8分钟，收集上清液。

3）清蛋白沉淀。向上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分沉淀清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。

盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在部分饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。另由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

2.透析除盐

1）检查透析袋

将透析袋两端用透析夹夹紧，装入蒸馏水，轻轻挤压，检查膜有无水渗出。若有水渗出，说明有小孔，不能使用。

2）装样透析

装透析管：取蛋白质的氯化钠溶液10ml，装入透析袋，然后放在盛有蒸馏水的烧杯中。40min后，自烧杯中取水1ml，加10%HNO3溶液1滴使成酸性，再加入AgNO3 溶液2滴，检验氯离子的存在与否。从烧杯中取水1ml水，进行双缩脲反应，检验是否有蛋白质的存在。不断更换烧杯中的蒸馏水，加速透析过程。

3）终点判定

数小时后，从烧杯中的水中不再能检出氯离子。此时停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质存在（此次应观察到透析袋中球蛋白沉淀的出现，这是因为球蛋白不溶于纯水的缘故）。

3.等电点法提取牛奶中的酪蛋白

取10ml牛奶3000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，水浴锅中加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL预热（40℃）的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心8min，弃去上清液，得酪蛋白粗品，加入无水乙醇5ml，震荡混匀后再离心，吸去上清液，置入烘箱中烘干，计算出每100ml牛奶所制备出的酪蛋白质量（g/100ml）（注意提前记录空管质量，作为空白）。

五、结果与讨论

1.蛋白质的盐析

根据实验结果，填写下表。

计算出每100ml牛奶所制备出的酪蛋白质量（g/100ml），并与理论产量（3.5 g/100ml）相比较，求出实际获得百分率。

1）含量：酪蛋白克数/100mL牛奶

2）

式中理论含量3.5g/100mL牛奶

六、思考题

1．列举除透析外的其他除盐方法，并比较优缺点。

2. 利用等电点法获得的酪蛋白纯度较低，请设计酪蛋白进一步纯化的方案，并画出技术路线图。

备注：

双缩脲反应：取一支试管，加蛋白质溶液1ml，再加10%NaOH 10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

实验中透析袋装液不可太多，否则涨破透析袋。装液后挤掉袋中空气，否则袋子在水中易漂浮。夹子要靠透析袋上面夹，即留有充分的吸水膨胀的余地。使用透析袋过程中注意不要指甲划破透析袋。下载本文