纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA 的检测
汪毅
1,2 毛红菊*2 臧国庆1 张宏莲2 金庆辉2 赵建龙21(上海交通大学附属第六人民医院,上海200062) 2(中国科学院上海微系统与信息技术研究所,上海200050)摘 要 利用两组探针修饰的微粒:(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(H B V )DNA 另一端结合的纳米金探
针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针);(2)表面标记有可与待测HBV DNA
一端结合的磁珠探针(捕捉探针1)。检测靶HBV DNA 时,磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBV DNA
靶序列一端结合最终形成三明治样结构。再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离,以DTT 溶液将信号
探针从纳米金颗粒上洗脱。洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡,信号探针一段与预先点样的基因芯片
上的捕捉探针2结合,检测探针与信号探针另一段相结合,最后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标
DNA 相对定量信息。结果表明,本检测方法的检测灵敏度达到10-15m o l/L 水平。检测时间少于1.5h ,检测
结果与HBV DNA 水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果;本方法有望用于乙肝病人血清中HBV DNA 的
快速筛测及其它微生物基因的检测。
关键词 乙肝病毒DNA;纳米金探针;生物条形码扩增;纳米探针芯片
2010-01-02收稿;2010-02-23接受
本文系国家卫生部重大专项(Nos .2009ZX10004-105,2009ZX10004-301)和上海市科委项目(Nos .0952n m 05700,09Z R1437800)资助*E-m ai:l h j m ao @m ai.l si m .ac .cn
1 引 言
乙型肝炎是乙肝病毒(H B V )所引起的一种传播快、潜伏期长、危害广的传染病,我国慢性无症状HBV 感染者或慢性无症状H B V 携带者已超过1.2亿,是H B V 感染者中存在数量最大的群体。采用有效的指标和方法实现早期诊断和病情监测对于控制传播、判断预后和指导用药都有重要意义[1]。
PC R 一直是临床上检测HBV DNA 的主要方法,具有较高的特异性和灵敏度,但却存在依赖酶促反应,所用试剂较为昂贵且不易保存,所需周期长和易污染,反应完毕后对其扩增的靶基因较难定量的缺点[2,3]。近年来,荧光定量PCR 试剂盒开始用于临床检测HBV,灵敏度高,定量分析效果好。其中,
SYBR Green 法不需要设计特异性探针,成本较低,但易产生假阳性结果
[4]。而Taq M an 探针法有着的特异性较好,但应用时需设计与目标序列互补的荧光探针[5]。
基因芯片技术在医学各个领域中的应用日益广泛[6,7]。但现阶段芯片检测的灵敏度不够高,在检
测核酸时低于PCR 扩增的灵敏度;其次基因芯片检测技术一般采用荧光标记探针技术,需配套昂贵的仪器来阅读和分析杂交信号,存在着系统成本过高,灵敏度低等问题;了基因芯片技术的应用
[8,9]。近年来,基于纳米材料的分子检测技术已被用于病原体和肿瘤相关DNA 检测
[10,11]、蛋白检测[12,13]以及m icro RNA 检测
[14]。纳米材料尤其是金纳米颗粒(Go ld nanoparti c les ,AuNPs),具有很好的生物相容性和较大的比表面积,金纳米粒子表面可以标记大量的生物活性分子(寡核苷酸探针或是蛋白分子)。Zhang 等[15,16]将固定于金电极表面的探针DNA 分子与靶分子结合,再加入与靶分子结合的
纳米金探针,形成夹心结构,通过伏安法测定修饰在纳米金上的六氨合钌的氧化还原电流,可以识别和测定溶液中互补的靶DNA,制成了具有纳米金放大作用的DNA 电化学生物传感器;或直接以硫化铅(PbS)超微粒和靶分子杂交,结合微分脉冲溶出伏安技术(DPASV)测定Pb 2+,从而间接判断靶分子的杂交情况[17]。但是上述电化学方法检测灵敏度仍不够高;且探针用量大,杂交过程繁琐,需专门仪器读取结
果,了该方法的应用。M izuo 等
[18]运用比色法检测靶DNA 的存在,结合了靶DNA 的纳米金探针(末端完全互补)在一定的盐离子浓度下会聚集。但其检测灵敏度不高,只能检测50~500 m ol/L 的目标DNA 分子。本研究基于M ir k i n 等[11]开发的BC A 技术,将纳米金颗粒标记的探针结合基因芯片方法用于第38卷
2010年8月 分析化学(FENX I HUAXUE ) 研究报告Ch i nese Journal o fA na l y ti ca l Che m istry 第8期1133~1138
HBV DNA 的检测,进一步优化了纳米金探针标记步骤和杂交条件,可在较短时间内完成对H B V DNA 的检测,灵敏度已能接近PCR 反应的检测灵敏度,有望用于乙肝病人血清中HBV DNA 的快速筛测。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Prosys 5510A 型芯片点样仪;J ASCO V-670型紫外-可见光光谱仪。纳米金溶液(平均粒径为15nm )、基因芯片(本实验室自制);杂交缓冲液(罗氏公司);羧基化的磁珠(Inv itrogen 公司);BSA (S i g m a 公司);0.1m o l/L PBS(p H 7.2,0.2mo l/L Na 2H PO 4-Na H 2PO 4,1.0m o l/L N a C l);胶体金重悬液(0.1m o l/L PBS ,1.0m ol/L N a C l);0.2 SSC 洗液(含0.1%SDS);银染液;N a NO 3洗液。所需引物、探针序列均由大连宝生物有限(Taka R a)公司合成(如表1所示)。其它试剂均为分析纯。
表1 待测HBV DNA 的PCR 序列及核酸探针序列
T able 1 Sequences of DNA probes and PCR pri m e rs of hepatitis B v irus(H B V )-DNA
序列名称Na m e
序列结构S truct u re 标记在磁珠上的氨基化捕捉探针-1O li gonucleoti d e -
m od ified m agnetic m icroparti cle p robe (capture prob e -1)
5 -NH 2-po l y(T )16-GTT CAT GTC CTA CTG TTC-3 标记纳米金的信号探针O ligonu cleoti de -mod i fi ed gold
nan oparti cle(NP)prob es 1(bar -code DNA)
5 -GTGCCTTGGGTGGCTTTG -PEG9m er -AGCTACGAA TAA -(CH 2)3-SH-3 标记纳米金的检测探针
O li gonu cl eoti de -m od ifi ed gol d NP probes 2(detect p robe)
5 -H S -(CH 2)3-Poly(A )10-TTA TTC GTA GCT -3 固定于芯片上的氨基化捕捉探针
Am i no -m od ified cap t u re DNA p robe (capture p robe)
5 -NH 2-pol y(A)16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3PCR 上游引物Ups trea m pri m er for PCR
5 -ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC -3 PCR 下游引物Down strea m pri m er for PCR
5 -CAGAGCAGAGGCGGTGTCG -3 2.2 实验方法
2.2.1 HBV DNA 样品制备 裂解法抽提阳性血清样品中HBV 基因组DNA,PCR 扩增参考文献[10]进行。PCR 体系:缓冲液1.5 L ,Taq 酶lU,25mm o l/L M gC120.8 L 、25mm o l/L dNTP 1.0 L,上下游引物各0.5 L ,引物终浓度为0.5pm ol/L ;将阳性血清裂解离心后,取1.5 L ,加二次蒸馏水至l5 L 。扩增条件:94 变性4m in ,94 变性30s ,54 变性30s ,72 变性30s ,35个循环,72 延伸4m i n 。
2.2.2 纳米金探针制备 配制1.0mm o l/L HAuC l 4溶液及38.8mm o l/L 柠檬酸三钠溶液。将HAuC l 4溶液加热至130 ,保证加热过程中搅拌充分,约20m in 后迅速加入新配的柠檬酸三钠溶液25mL(此过程中注意保温),持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液。以0.22 m 纤维尼龙膜过滤溶液,即可得到颗粒均匀的纳米金溶液。两种纳米金颗粒表面标记巯基修饰的DNA 探针的修饰方法:一种为可与靶DNA 部分序列互补结合并带有巯基的寡核苷酸探针,3 端修饰巯基的寡核苷酸探针和金纳米粒子以共价键结合,使寡核苷酸牢固地结合在纳米金表面形成信号探针(表1);另一种可与上信号探针部分序列结合,该寡核苷酸探针3 端亦以巯基修饰,结合基因芯片对信号探针进行检测,为检测探针。标记方法:取10nm o l/L 15nm 纳米金溶液1.0mL ,以9000r /m in 离心50m i n ,去上清液,以100 L 无菌去离子水重悬;加入DNA 探针使其终浓度为3 m o l/L,室温放置16h ;分3次加入0.1m o l/L PBS(p H 7.2)至终浓度分别为100和10mm o l/L,混匀,室温放置48h 以上;用0.01m o l/L PBS 溶液以9000r /m in 离心清洗50m i n 两次,去上清液,以100 L 0.01m o l/L PBS 重悬,4 储存备用。用紫外-可见光光谱仪测其吸光光谱及OD 值,用透射电镜扫描DNA 探针标记前后的纳米金。
2.2.3 磁珠探针标记 根据H B V DNA 保守序列,设计一段捕捉探针-1(表1),标记于磁珠上,用于捕捉样品中的HBV DNA 。取PCR 管,吸取未标记磁珠50 L (10g /L ),将50 L 磁珠与100 L MES (25mm ol/L ,p H 6)混合,充分混匀后磁分离。加入新配10g /L N-乙基-N -(3-二乙氨基丙基)碳二亚胺(EDC )和10g /L N -羟基琥珀酰亚胺(NH S )各50 L ,室温孵育40m in ;将上孵育后磁珠以PBS (p H 7.4)清洗,磁分离后加入90 LM ES 及HBV 捕捉探针9 L (100p m o l/L),室温孵育1h 。反应完毕后将连接后磁珠以PBS(p H 7.4)清洗,磁分离后加入100 L T ris -H C l (0.05m o l/L ,p H 7.4),孵育15m in ,将磁珠未反应表面封闭;灭活后以PBS -BSA (0.1%,w /V )清洗后磁分离,重悬保存于50 L 1134 分析化学第38卷
PBS-BSA (0.1%,w /V )中。
2.2.4 DNA 芯片制备 根据信号探针序列设计,可与其部分互补结合的捕捉探针-2(表1);将氨基化修饰的捕捉探针通过芯片点样仪点到表面醛基化的在玻片上,点直径100 m,点间距500 m,点样量为0.7nL,DNA 探针浓度为75 m o l/L ,37 固定。未结合的探针以去离子水冲洗,浸泡于40mm o l/L 巯基琥珀酸溶液中30m i n 以钝化其余结合位点,以去离子水多次冲洗后,4 备用。
2.2.5 磁珠探针-目标DNA -纳米金结合探针的连接及洗脱 在H B V 目标DNA 存在时,标记有H B V DNA 捕捉探针的磁性颗粒和纳米金信号探针通过互补序列分别与靶分子杂交,形成类似 三明治 的结构。利用磁场可将这种结合物从溶液中分离出来。通过洗涤除去未结合的纳米金颗粒及其它反应物后,将沉淀重新悬浮。在重悬后溶液中加入二硫苏糖醇(DTT )可将纳米金颗粒表面的未与H BV DNA 结合的探针DNA 从其表面解离,释放到溶液中,这些探针DNA 可作为放大信号的条形码DNA (b i o -barcode DNA)
用于检测。
图1 基于BCA 技术的纳米探针标记及杂交检测过程示意图
F i g .1 Sche m a tic o f preparati on o f nano -probes and hybridization procedure based on b i o -barcode
a m plifi cation(BCA )
将PC R 扩增产物(约10-7
m o l/L)按100,1000,10000和100000倍比梯度稀释。取2 L 标记后磁珠和2 L 靶DNA (PCR 稀释样本需经95 变性5m in ,分解为单链),加入17 L 杂交液混匀,总体积21 L ,48 杂交10m in 。杂交完毕后加入2 L 纳米金信号探针,总体积约为23 L ,混匀后50 杂交40m in ,杂交结束后以A ssay 缓冲液清洗(去除未结合的纳米结合探针和H B V DNA ),磁分离后移去上清液。加入新配制的0.5m o l/L DTT 溶液(溶解于A ssay 缓冲液中)20 L ,室温下洗脱10m in 后磁场分离,吸取上清液,供芯片杂交分析。
2.2.6 基因芯片检测 取2 L 洗脱液和12 L 杂交液,混匀,均匀滴入芯片点阵区,40 杂交30m i n 。以0.2 SSC (含0.1%SDS)洗液清洗芯片3~5m in ,氮气吹干待用。
取检测探针1 L,加入杂交液12 L ,混匀后均匀滴入芯片点阵区,40 杂交30m in ;杂交完毕后以N a NO 3洗液清洗3m in ,氮气吹干。每点阵均匀加入新制银染液20 L(避光操作),室温反应10m i n 后置于去离子水以终止反应,镜下观察。1135第8期汪毅等:纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA 的检测
3 结果与讨论
3.1 纳米金探针制备及表征结果分析
如TE M 图(图2)所示,未标记DNA 探针的纳米金颗粒周围界面清晰;而标记后的纳米金颗粒围有一层灰黑色的疏水区域,表明DNA 探针标记到纳米金颗粒表面,且可见DNA 探针的标记并未使纳米金颗粒聚集,其仍稳定存在,
分散性好。
图2 标记DNA 探针前(a)和后(b)的纳米金透射电镜图
F i g .2 TE M i m ages o f bare A u nanopa rti c l e(A uNP )(a)and A uNP m odified w ith DNA probes (b)
随着粒径的增大,纳米金溶液对应吸收峰的峰位呈现向长波段红移的趋势[19,20]。从光谱扫描图
(图3)可见,标记了DNA 探针的纳米金最大吸收峰的波长较未标记后移了约5.0nm,由520nm 后移到近525nm 处。DNA 分子标记到纳米金颗粒的表面,使纳米金粒子尺寸和形状较之前略增大,
吸光值也 图3 15n m 纳米金标记寡核苷酸前后的紫外吸收光谱F ig .3 UV-V is spectra o f AuNP probes 1.520nm 处未标记的纳米金(Unm od ified AuNPs at 520nn );2.525nm 标记后的纳米金(DNA m od ified
AuNPsat 525nm )。
随之变大。
3.2 核酸检测结果与分析
3.2.1 纳米金探针浓度对检测的影响 杂交体系中纳米
金探针含量低会导致基因芯片的信号减弱,降低反应灵敏
度。而过量的信号探针会使得基因芯片杂交信号强度过
高,导致可能出现假阳性。不同浓度的纳米金信号探针杂
交对最终基因芯片杂交信号的影响见图4。芯片杂交信号随
纳米金探针浓度升高而增强,当纳米金探针为8.7n m o l/L 时
达到最高值,继续提高信号探针浓度不能提高信号强度,故本实验中纳米金信号探针最适浓度为8.7nm ol/L 。
3.2.2 磁珠探针浓度对检测的影响 磁珠探针量不足会
导致芯片杂交信号降低,降低检测靶DNA 的灵敏度;而磁
珠浓度过高会造成浪费。由图5可知,本实验中最适磁珠浓度为1.5g /L 。
3.2.3 纳米金探针-磁珠探针杂交时间对检测的影响 考察了第二步杂交时间对分析结果的影响。此步杂交为纳米金信号探针与已结合磁珠探针的靶DNA 之间的反应。结果表明,杂交在40m i n 内即可基本完成。延长杂交时间不能明显增强反应信号。另外,对第一步磁珠探针与靶DNA 的杂交时间也经过测试,二者杂交10m i n 内即可完成;延长杂交时间不能增强最终信号。整个杂交实验过程可在1h 内完成。
3.2.4 纳米金探针检测不同浓度核酸
由图6所示,本方法对目标核酸分子检出限为10-15m ol/L ,接近PCR 反应检测水平(5~10个拷贝DNA 分子)。检测的信号好,点阵清晰,背景低,且随目标DNA 分子浓度降低,信号结果呈现减弱趋势变化,差异明显。对染色后芯片做灰度分析(图7),银染后灰度值与H B V DNA 浓度呈近似线性相关,证实本反应体系的稳定性和实验结果的可靠性。
1136 分析化学第38卷
F i g.4 E ffect o f concentrati on of ba r-code DNA m od ifi ed A uNP s on ch i p-based de tecti
on 图5 磁珠捕捉探针浓度的影响
F i g.5 Effect of concentration o f capture probe-1mod ified m agntic m icropa rti c l es(MM P s)on chip-based
detection
图6 纳米金探针检测不同浓度(m o l/L)H BV靶序列
的芯片结果
F i g.6 R esults of detection for HBV targe t DNA w ith di-f
feren t concentra ti on(m o l/L)by chi p-based detecti
on
图7 HBV DNA浓度梯度实验结果灰度测定的标准化
曲线每个浓度对应结果取3次实验均数
F i g.7 A nor m a lized g raysca le i ntensity cali brati on curve
f o r H B V DNA concen trati on.T he result i s from3i nde-
pendent exper i m ents
近年来,利用纳米探针标记技术检测HBV DNA已有报道。习东等[21]通过纳米金颗粒基因探针与HBV DNA样本杂交,敏感度可达103cop ies/mL,无需扩增直接用于对乙肝病人阳性血清中提取的H B V DNA的检测。但是液相中杂交现象不直观,结果需要通过昂贵的透射电镜观察。李玮等[22]基于纳米金标记探针的目视化乙肝病毒基因芯片的研究,将目标HBV DNA分子先和芯片上捕捉探针结合,然后再与合成的纳米金检测探针结合从而放大信号。该方法检出限低至10-9mo l/L靶DNA,其灵敏度和荧光标记法相同,检测HBV DNA尚达不到PCR方法的灵敏度。本方法对目标核酸分子的检出限为1.0 10-15m o l/L,已接近PCR反应的检出限。结合基因芯片可以达到目视化检测,芯片杂交结果能较好地反映靶序列的浓度,实验结果与HBV DNA浓度呈现良好的线性关系。纳米金探针通过标记一定比例的结合探针和检测探针,不但放大了检测信号,还提高了基因芯片杂交反应的特异性。本芯片杂交结果只需普通的商用扫描仪或普通的倒置显微镜采集信号,具有成本低、重复性好等特点。本方法操作简单,且杂交结果背景低、稳定,易于保存,有望用于临床检验。
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1
(D e p ar t m ent of Infection ,t he Six t h P eop les H o sp ital Affiliated to Shanghai J iao t ong University,Shanghai 200233)2(Shanghai Institute of M icro sys te m an d Information T ec hno logy,Chinese A cade my of Sciences,Shanghai 200050)
Abst ract A nanoparticle -based b i o -barcode a m plifi c ation (BCA )approach w as deve l o ped for the sensiti v e detection o f hepatitis B v ir us (H BV)DNA.The BCA approach e m ployed t w o sets of particles :(1)t w o -co m -ponent o ligonucleo ti d e -m odified gold nanoparticles (AuNPs):one o li g onuc -leo ti d e probe called si g na l probe (barcode DNA )is partial co m ple m entary w ith the target sequence o fH B V DNA and another one ca lled detec -ti o n probe is partial co mp le m entary w ith t h e si g na lprobe ;(2)sing le co m ponent o li g onuc leotide m odified m ag -netic m icroparticles (MM Ps).In the presence of the targetm olecule ,the go ld nanoparti c les and m agnetic par -ticles for m ed sandw ich hybrids .A long w ith the iso lation of sandw iched hybrids fro m the sa m ple usi n g a m ag -ne,t non -specific bound go l d nanopartic les w ere re m oved ,ensuri n g that on ly targe-t bound go l d nanoparticles w ere co llected.Subsequentl y ,t h e bar -code DNAs w ere dehybridized fro m the gold nanoparticle by usi n g the dith i o threitol (DTT ).The detection probe w ith AuNP m i x ed w ith bar -code DNA so l u tion w as then added to a bar -code capture DNA-m odified ch ip ,and the spots on ch i p w ere l a be led w ith bar -code DNA strands and AuNP pr obes .Fina ll y ,the scano m etric detection o f sil v er stain w as intr oduced to further a mp lify t h e si g na.l The resu lts sho w ed that it w as possible in a for m at that offers lo w f m o l/L (10-15m o l/L )sensitiv ity i n the detection o fHBV DNA sa m ple and t h ere is a good linear relationsh i p be t w een tar get concentration and spo t i n tensity on ch i p .The detection o f the assay could be f u lfilled w ithin 1.5h .The m ethod cou l d pr ov i d e a ne w generati o n of diagnosti c assays for H B V or the o ther i n fecti o us d isease .
K eywords H epatitis B v ir us deoxyribonuc leic acid ;Gold nanopartic le probes ;B i o -barcode a mp lification ;nanopartic le probe chip -based detection
(Received 2Janu ary 2010;accep ted 23Feb ruary 2010)1138 分析化学第38卷下载本文
