本科学生实验报告
本科学生实验报告
学号 ********* 姓 名 王娜
学院 生命科学学院 专业、班级 生物技术10级
实验课程名称 酶工程学《实验》
指导教师 李 俊 俊
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 4 月 20 日
云南师范大学教务处编印
| 实验名称 | 实验方式 | 小组成员 | ||||
| 实验二、纤维素酶最适反应温度的测定 | 分小组合作 | 全班同学 | ||||
| 一、实验目的 1、了解不同温度条件对酶活性的影响 2、掌握酶最适反应温度的测定方法 | ||||||
| 二、实验原理 温度对酶促反应速率的影响有两方面：一方面，温度升高可加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而使反应速率加快；另一方面，温度升高可能使酶蛋白逐步变性而失活，从而降低酶促反应速率。温度对酶促反应速率的影响是这两方面作用的综合结果。所以只有在某一温度范围内时，酶促反应速率才会随着温度的升高而升高，达到最大反应速率时的温度称为酶作用的最适温度（Optimum Temperature）。 将其它条件（如酶浓度、底物浓度、pH、反应时间等）固定在最适状态，然后在一系列不同温度条件下进行酶活力测定。绘制得到温度——酶活力曲线。酶的最适温度并不是酶的特征常数，受其它因素的影响。 | ||||||
| 三、实验试剂及材料 实验试剂 1、柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L pH4.8（适用于酸性纤维素酶） 2、磷酸缓冲液， 0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶） 3、CMC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0 ） 4、DNS试剂（CMCA-DNS） 5、纤维素酶液（ pH4.8和pH6.0） | ||||||
| 实验 | ||||||
| 4、实验方法步骤及注意事项： 4.1根霉曲的制备步骤： 4.1.1培养基的配制与灭菌（约60%含水量） 麦麸20g＋20ml水 /人 → 放入烧杯拌匀（以组为单位）→ 分装于三角瓶 →包上纱布（至少6层） → 包报纸4层 → 包 扎→ 120℃灭菌1h→ 摇动打散瓶内培养基→冷却至约30℃ 4.1.2接种（ AS3.866 ） 液体接种，接种量5%→无菌操作进行接种（在超净工作台中进行）→摇匀 →包扎→ 在瓶壁上写上姓名、接种日期。 4.1.3培养 接种后的三角瓶倾斜平放→28℃培养24h → 扣瓶 →继续培养约24~48h →出料（烘干、磨碎）→根霉曲 4.2根曲霉糖化力的测定步骤： 4.2.1绘制标准曲线的方法 4.2.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。 4.2.1.2浓度c为横坐标，OD为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 4.2.1.3然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 4.2.1.5 0.1%葡萄糖标准曲线的制作： 取7支试管，编号，按照下表进行操作：如表一所示 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 葡萄糖溶液 体积（ml） | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 葡萄糖含量 （mg） | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 缓冲液（ml） | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 |
| DNS (ml) | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 定容总体积(ml) | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
| OD（540nm） | ||||||
表一
4.2.2酶液的制备
将小块状的根霉曲用研钵研碎，取2克根霉曲溶解到20毫升缓冲液中，混合搅
拌10分钟，离心取上清液液备用。
4.2.3糖化酶酶活测定
取酶液按照下表要求操作测定酶活：如表二所示
| 操作步骤 | 空白管 | 样品管A | 样品管B |
| 步骤1 | 吸取1.8mL淀粉底物溶液 | 吸取1.8mL淀粉底物溶液 | 吸取1.8mL淀粉底物溶液 |
| 步骤2 | 50℃保温5分钟 | 50℃保温5分钟 | 50℃保温5分钟 |
| 步骤3 | —— | 加入待测酶液0.2毫升 | 加入待测酶液0.2毫升 |
| 步骤4 | 50℃精确保温10min | 50℃精确保温10min | 50℃精确保温10min |
| 步骤5 | 加入3mLDNS试剂终止反应 | 加入3mLDNS试剂终止反应 | 加入3mLDNS试剂终止反应 |
| 步骤6 | 混合均匀 | 混合均匀 | 混合均匀 |
| 步骤7 | 加入0.2毫升待测酶液， 沸水浴煮沸5min | 沸水浴煮沸5min | 沸水浴煮沸5min |
| 步骤8 | 流水冷却 | 流水冷却 | 流水冷却 |
| 步骤9 | 加蒸馏水10mL，混匀 | 加蒸馏水10mL，混匀 | 加蒸馏水10mL，混匀 |
| 步骤10 | OD540nm比色 | OD540nm比色 | OD540nm比色 |
表二
4.2.4淀粉酶的液化效果试验
取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50℃预热5分钟，加入酶液1毫升，反
应5分钟，取5毫升稀碘液检测淀粉显色情况。
4.2.5酶活测定注意事项
1、试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
2、移液的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换头。
3、精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
| 4、避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； | ||||||
| 5 实验处理 5.1实验现象、数据及观察结果 5.1.1根霉曲的制备： 接种24小时后，看到三角瓶壁和麦麸之间有灰白色小绒毛状物，白色小绒毛状物比较集中在一个区域。扣瓶 24 小时后烘干时成灰黑色的小块状根霉曲， 5.1.2标准曲线的测量结果：如表三 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| OD（540nm）值 | 0.00 | 0.0 | 0.195 | 0.338 | 0.468 | 0.613 |
5.1.3糖化酶活力测定现象及结果：如表四
| 空白管 | 样品管A | 样品管B | |
| 浅棕色 | 棕黄色 | 棕黄色 | |
| OD540nm | 0.00 | 0.556 | 0.558 |
5.2对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：
5.2.1葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线如上图所示，得到回归直线方程y=kx+0.1068，k=1.4228，R2=0.9997>0.99，该标准曲线具有很好的相关性。Y表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度,0.1068表示补偿参数。
5.2.2糖化酶活测定结果
实验结果测得OD540的平均值为0.557，带入标准曲线计算得根曲霉糖化力为0.1753U/ml，这个结果和预期结果相差不大。
5. 2.3淀粉酶的液化效果试验
| 当向加了酶液的试管中加入碘液时，试管中溶液颜色没有变化，加了酶液的试管里面溶液变蓝色，说明淀粉酶将底物淀粉还原成了糖类，所以当加入碘液的时候，溶液没有颜色变化；颜色变蓝的试管说明里面的淀粉没有被还原成糖类，淀粉还在。 | ||
| 6、实验小结 这次试验培养根酶曲，培养出了灰黑色的小块状根霉曲，为下步实验的进行做了准备。在做酶工程实验时绘制出了葡萄糖标准曲线，本次实验与之运用同一个标准曲线来进行实验结果分析。之后进行的糖活化力的测定，对照试验使之现象明显。这两次实验进行得都很顺利，但是还是存在一定的实验误差，在以后的实验过程中应该更加精细实验，使实验结果更准确。 我们以分组的形式进行实验，在实验过程中，大家相互配合，曾强了我们团结协作的意识及能力。 | ||
| 7、实验思考题 (1)、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键你认为是什么？为什么？ 答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。 关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其它酶产物给测定结果带来的误差。 (2)、本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？ 答：消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所得的多余溶质对光的吸收。 | ||
| 8、指导老师评语及得分： 签名： 2013年 04月 日 |
