琼脂糖凝胶（大分子DNA，水平式）聚丙烯酰胺凝胶（小分子DNA，蛋白质，竖式）荧光染料EB（溴化乙锭）在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。性内切酶切割DNA的方式：粘性末端和平整末端。大肠杆菌利用乳糖需要的两个酶：促使乳糖进入细菌的半乳糖透过酶；催化乳糖大肠杆菌利用乳糖需要的两个酶：分解第一步的β-半乳糖苷酶。性内切酶：指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。根据性内切酶的识别位点和切割位点及所需要的辅助因子分类。I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。Ⅱ型：基因工程的工具酶。Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。II型性内切酶的主要用途：(1)在特异位点上切割DNA，产生特异的酶切割的DNA片段(2)建立DNA分子的性内切酶物理图谱；(3)构建基因文库 (4)用酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质：一条单链多肽；5`→3`DNA聚合酶活性；5`→3`外切酶活性，位于N端；3`→5` 外切酶活性；用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5`→3`外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。基因载体:是一类将外源DNA或基因带入宿主细胞的能自我复制的DNA分子。其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。特征能在宿主细胞内和稳定的自我复制；易于从宿主细胞中分离，便于纯化；具有多种单一的性内切酶酶切位点；具有合适的遗传标记基因。常用的基因载体：细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯氏质粒载体和植物病毒载体。克隆载体质粒必须具备的基本条件：具有复制起点；具有一个或多个选择标记基因；具有若干酶单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数。质粒：存在于细胞质中的一类于染色体的自主复制的双链环状DNA分子α-互补筛选原理：1、在相应载体系统中，lacZ△M15放在F质粒上,随宿主传代；lacZ ’放在载体上,作为筛选标记。2、IPTG: lac操纵子的诱导物; X-gal：β-半乳糖苷酶的显色底物。3、lacZ ’编码区上游插入小段 DNA片段，51个bp的多克隆位点，不影响α-互补。4、若在该多克隆位点中再插入一个大片段，导致α-互补失效。pBR322组成部分：来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）pSC101质粒的四环素抗性基因（Tet）ColE1的派生质粒Pmb1的DNA复制起点（ori）特性：较小的分子量，4363bp；选择标记:Amp、Tet；筛选形式:抗性插入失；活较高拷贝数，氯霉素扩增，1000-3000个拷贝；单一切点:24个。pUC19带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因lacZ’的调节片段，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。多克隆位点：MCSλ噬菌体的形态结构：有尾部结构的二十面体：二十面体的头部，中空的针状结构及外鞘组成的尾部，尾丝和尾针组成的基部。表达载体与克隆载体区别:携带外源DNA并使之在宿主细胞中表达的载体。启动子：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点；终止子：转录过程中能够终止RNA聚合酶转录的DNA序列。使RNA合成终止；SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。目的基因：根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子片段。获得目的基因的途径：直接分离法；PCR扩增；构建基因组文库法；构建cDNA文库法；化学合成法。食品科学中的应用：基因科学研究；食品微生物检测；转基因食品检测；食品组分检测。多聚酶链式反应技术是指在模板DNA、、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段的技术。PCR基本原理：在进行PCR扩增时，通常需要设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的的区段下的另一条模板链的序列相互补。将热变性后分开的两条模板链与摩尔数大为过量的两个引物共同温育复性产生的模板–引物杂交体作为作用底物，利用耐热的TaqDAN聚合酶催化延伸合成反应。如此变性、复性、延伸合成周而复始地循环进行，使两引物所限定区间的目的DNA片段得到指数式扩增。PCR反应体系①模板：单链或双链DNA②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤ 反应缓冲液：Mg2+、目的基因与载体的连接原理：经性内切酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，将两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基新形成３’,５’－磷酸二酯键的过程。连接方式：粘性末端连接；平端连接；人工接头连接；同聚物加尾连接。粘性末端连接方式：同一酶切位点连接；不同酶切位点连接，配伍末端连接。感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的细胞。受体细胞也叫宿主细胞，是能摄取外源DNA，使外源DNA进行复制，并且能够表达重组体所带有的表型特征的细胞。转化：使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。重组DNA向受体细胞转化反应方法：化合物诱导转化法。冰水浴中用一定浓度的氯化钙处理对数生长期的细菌，以获得高效转化的感受态细胞。重组子的筛选：根据载体表型特征（1）pBR322抗菌素标记选择：插入失活2）pUC系列β-半乳糖苷酶显色反应选择法），根据插入序列的表型特征（1）弥补缺陷2.利用报告基因筛选植物转化细胞。基本原理：构建重组体时，将目的基因与报告基因构建在一起，由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此识别重组体）。利用报告基因筛选植物转化细胞原理：构建重组体时，将目的基因与报告基因构建在一起，由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此识别重组体。作为报告基因，其表达产物应是便于检测、定量和灵敏度高的基因。基因工程在食品产业中的应用：利用基因工程改造食品微生物；改善食品原料的品质；改进食品生产工艺；生产食品添加剂及功能性食品。单个细胞的生长细胞周期：指正常连续的细胞从前一次结束到下一次细胞完成所经历的连续动态过程，所需的时间叫细胞周期时间；不同的细胞，细胞周期不同。细胞群体的生长，生长曲线：定量描述液体培养基中细胞群体生长规律的实验曲线（滞后期，对数生长期，稳定期，衰亡期）细胞全能性：一个与合子具有相同遗传内容的体细胞具有产生完整生物个体的潜在能力。植物细胞培养：在离体条件下，将愈伤组织等置于液体培养基中震荡培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。愈伤组织：原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型、疏散排列的薄壁细胞。植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。植物细胞培养基无机盐：“大量元素”和“微量元素”碳源：蔗糖、葡萄糖，果糖；植物生长激素：生长素：吲哚乙酸和萘乙酸；素：腺嘌呤衍生物，6-苄氨基嘌呤、玉米素；有机氮源：蛋白质水解物、谷氨酰胺、氨基酸；维生素：硫胺素，烟酸、泛酸、生物素、叶酸；复合物质：细胞生长调节剂，酵母抽提液、植物细胞悬浮培养流程1）诱导产生愈伤组织2）继代培养：愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性3）悬浮培养 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物4）过滤、离心，获得游离细胞5）悬浮培养。成功体系必须满足的基本条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性好；生长迅速。悬浮培养的基本形式分批培养（基质浓度随温度升高而减少，细胞浓度和产物增多）、连续培养、半连续培养。动物细胞培养：是指从机体取出动物组织或细胞，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长与增殖。悬浮型细胞：生长时呈悬浮状态。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型。贴附型细胞：附着于带适量正电荷的固体或半固体。大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞都属于这一类型。组成培养基：氨基酸；维生素；无机盐；糖类；有机添加剂；激素和生长因素；其它成分。常用培养基：天然培养基：血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质；组织浸出液：能促进细胞生长；水解乳蛋白：氨基酸含量高。合成培养基：血清质量好坏是实验成败的关键。无血清培养基的主要研制策略：在基本培养基中补充促细胞生长因子如激素、生长因子、结合蛋白 、贴壁和扩展因子。悬浮培养：小规模培养，采用转瓶和滚瓶培养方式；大规模培养，发酵罐式的细胞培养反应器。贴壁培养：是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养。大多数哺乳动物细胞属于贴壁依赖性细胞。微载体系统。细胞贴壁的步骤包括：贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展。大规模培养方法1悬浮培养2空心纤维法：用聚砜或丙烯聚合物制成的中空管状纤维，表面多孔。3微载体培养：细胞贴壁生长在微载体表面上，载体在轻度搅拌下携带细胞悬浮在培养液中.4微囊培养:细胞在各自微小环境中生长，当细胞密度达到一定数值时，收集微囊，破开微囊获得高度纯化的大分子产物。冻存和复苏的原则：慢冻快融。当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞融合经历的过程：1两个亲本细胞并列2细胞膜相接触3膜组织局部破坏4形成包围融合细胞的连续包膜。细胞融合：在离体条件下，用人工方法将不同来源的原生质体融合成一个杂合细胞，生产特殊生物制品或形成新品种的技术。也称体细胞杂交、原生质体融合。融合关键：形成细胞桥，要有脂双层的接触，并需要出去糖蛋白，露出无糖蛋白覆盖的区域。融合方法：生物法—仙台病毒法；化学法—PEG；物理法—电融合法植物原生质体的制备：取材与除菌；酶解；分离；洗涤；鉴定 植物细胞工程在食品工业中的应用（1）生产香料和色素（2）生产食品添加剂（3）生产天然食品动物细胞工程及其在食品工业中的应用（1）在疫苗生产上的应用（2）在干扰素生产上的应用（3）在单克隆抗体生产上的应用（4）在其他基因重组产品生产上的应用。蛋白质的生物学功能：1.催化功能：2.调节功能3.结构功能4.运输功能5.免疫功能6.运动功能7.储藏功能8.生物膜功能。蛋白质在食品中的典型功能：溶解性，持水性，粘度，胶凝性，粘结粘合，弹性，乳化性，起泡性，脂肪和风味结合。蛋白质工程主要内容：1）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系 基本目的：1）实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能2）设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质 蛋白质改造方法：.1 初级改造（个别Aa的改变或一段Aa序列的删除、置换或插入）2 高级改造：结构域的拼接3 从头设计合成新型蛋白质（从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的片段，进行修改和组合；构建一个多肽链骨架模型；依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基位置上的氨基酸；优化目标蛋白的三维模型；检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进一步修正；几轮设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白）蛋白质工程在食品产业中的应用：消除酶的被抑制特性；引入二硫键，改变蛋白质的热稳定性；改变酶的最适pH值条件；提高酶的催化活性；修饰酶的催化特异性；修饰Nisin的生物防腐效应。发酵工程研究内容：上游工程：物料输送和原料预处理；培养基选择、制备及灭菌；菌种选育、保藏、复壮和扩大培养；发酵动力学；发酵醪的特性；氧的传递溶解和吸收；发酵设备的设计、选型和计算；发酵过程的工艺技术控制。下游：产物分离、提取和精制；辅助：空气净化除菌与调节系统；水处理和供水系统；加热和制冷系统。发酵产品类型：细胞生产的培养与发酵生产；生物酶；生物细胞代谢产物，生物转化发酵。发酵过程中特殊成分的添加：1前体物质 ：氨基酸、核苷酸、抗生素2促进剂：酶的诱导剂、改善通气、增加膜的通透性、植物生长激素，表面活性剂3抑制剂：延迟菌体自溶、抑制其他合成途径，巴比妥 对数残留定律t=(1/K)ln(N0/Nt)N0—开始灭菌时原有活菌数，Nt----经时间t后残存活菌数。K—热致死速率常数（min-1），此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；t：热致死时间。K是微生物耐热性的特征，与微生物种类和灭菌温度有关。K值愈小，则此微生物愈耐热。阿累尼乌斯方程K=Aexp(－ΔE/RT) K—灭菌速度常数（min-1)A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，min-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。达到相同灭菌效果，提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间。T↑微生物死亡速率＞培养基成分破坏速率。新种分离与筛选的步骤：1）定方案2）采样3）增殖培养： 4）纯种分离： 5）性能测定。育种：按照发酵要求，根据微生物遗传变异理论，对现有的发酵菌种的生产性状进行改造或改良，以提高产量、改进质量、降低成本。类型：诱变育种：射线、化学诱变剂。杂交育种：两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合遗传物质重新组合，在从中分离和筛选初具有新性状菌株的育种方法。基因工程定向育种。菌种保藏方法：斜面低温保藏法；液体石蜡保藏法；真空干燥法：液氮冷冻保藏技术（ -150－-130℃ ）菌种扩大培养的一般工艺流程：实验室阶段菌种的扩大培养，原种活化—试管固体或液体培养—三角瓶液体振荡培养--生产车间菌种的培养：种子罐培养—扩大的种子罐培养—发酵罐。种子级数越少越好。发酵动力学：以化学热力学（研究反应方向）和化学动力学（研究反应速度）为基础，研究发酵过程中细胞生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。Monod 模型: µ=µM) S/( Ks+ S)μ与培养基中残留的生长性底物S的关系；μ：菌体的生长比速；μm: 最大比生长速度；S ：性底物浓度，m mol/L ； Ks：饱和常数，m mol/L，等于处于1/2μm时的底物浓度。对数生长期，S远远大于Ks。μ与S成正比，营养物质的浓度了菌体的生长。表征微生物对底物的亲和力，Ks越大，微生物对基质的亲和力越弱。好氧液体发酵设备：机械搅拌发酵罐；自吸式发酵罐；气升式发酵罐；伍式发酵罐；机械搅拌发酵罐通风原理：罐内通风，靠机械搅拌作用使气泡分割细碎，与培养基充分混合，密切接触，以提高氧的吸收系数。结构部件：罐体、搅拌器、挡板、通风管、热交换器、消泡器、联轴器、中间轴承、端面轴封、变速装置、人孔、视镜等。搅拌器作用：使通入的空气分散成气泡并与发酵液充分混合，延长气液混合时间，加速提高溶氧溶，有利于传质和传热。挡板作用: 改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。防止搅拌过程中漩涡的产生，而导致搅拌器露在料液以上，起不到搅拌作用。热交换器:夹套式换热装置,竖式蛇管换热装置，竖式列管(排管)换热装置。影响发酵温度的因素：发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。产热因素：生物热、搅拌热。散热因素：蒸发热、辐射热。温度对发酵的影响：1对微生物生长的影响。在生物学的范围内，温度每升高10°，微生物的生长速度加快1倍。高温杀死微生物，低温抑制微生物生长。2影响各种酶的反应速率和蛋白质性质3影响发酵液的物理性质4影响生物合成的方向（金色链霉菌：T<30 ℃，金霉素;30 ℃ 35 ℃，四环素。）5.同义菌株的细胞生长和代谢产物积累的嘴是温度往往不同。pH值对发酵影响：酶的活性；细胞膜所带电荷的状态，细胞膜渗透性；菌体代谢过程，代谢产物的质量和比例；培养基某些组分和中间代谢产物的离解。发酵中pH的控制：调节培养基的原始PH，添加缓冲剂；调节基础培养基的配方：调节碳源、氮源比例和种类；加入弱酸或弱碱进行PH调节；补料控制：直接加酸加碱；补加碳源或氮源影响pH下降因素：1碳源过量、补糖过多2消泡油添加过量3生理酸性物质的生成pH上升：1氮源过多2生理碱性物质的生成 3中间补料，碱性物质添加过多（pH的控制）4调节基础培养基的配方 (调节碳源、氮源比例和种类 ,添加缓冲剂) 5补料控制 6直接加酸加碱7补加碳源或氮源。临界氧浓度：不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。发酵过程的溶氧变化发酵前期：微生物大量繁殖，需氧超过供氧，溶氧明显下降；发酵中后期：受工艺控制手段影响，如补料、时机和方式等；发酵后期：菌体衰老，呼吸减弱，溶氧逐步上升。溶氧的控制:N=kLα（C※-CL）1调节通风量、搅拌速度2提高罐压，采用富集氧3降低培养基浓度和粘度，补料方式4消泡5 径高比小的发酵罐。泡沫对发酵的不利影响: 1降低发酵设备的利用率2增加了菌群的非均一性3增加了染菌的机会4导致产物的损失5消泡剂会给后提取工序带来困难。消泡剂选择：表面活性剂，表面张力、亲水性；在水中的溶解度较小；无毒，对菌体生长和代谢无影响；不干扰溶解氧、pH等测定仪表使用，最好不影响氧的传递；良好的热稳定性；来源方便，价格便宜。化学消泡法天然油脂类:玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油；聚醚类:聚氧丙烯甘油,聚氧乙烯氧丙烯甘油；醇类:如十八醇、聚二醇；硅酮类（聚硅油类）；氟化烷烃。机械消泡：原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂。优点：不需引入外来物质，减少污染机会，并可减少培养液性质复杂化的程度。缺点：不如化学消泡迅速可靠，需要一定的设备和消耗一定的动力；不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。物理消泡法（改变温度和培养基成分）发酵液的特性：①目标产物在发酵液中浓度低，处理体积大；②发酵液成分复杂，菌体、培养基、酶、代谢物；③发酵液呈悬浮态，粘度大、不易过滤④目标产物性质不稳定。基本路线：预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化、成品加工。发酵液的预处理：加热（降低悬浮液粘度，提高过滤效率）；调节发酵液pH；凝聚（在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定出现聚集的现象。）与絮凝（某些高分子絮凝剂存在的情况下，基于架桥作用，使胶粒形成絮凝团的过程）。固液分离：离心、过滤（压力板框过滤机、真空、错流）细胞破碎方法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、化学渗透法、酶溶法等。初步纯化的单元操作有萃取（利用溶质在互不相溶的两相溶剂之间分配系数的不同而使得溶质得到纯化或浓缩的方法）吸附（磷酸钙，硅藻土，聚酰胺，离子交换吸附）、沉淀（盐析硫酸铵，有机溶剂丙酮）、膜分离等。

食品生物技术：现代生物技术在食品领域中的应用，以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。关系：基于现代分子生物学基础上的基因工程技术是食品生物技术的核心和基础，它贯穿于细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、生物工程下游技术和现代分子检测的技术之中。而细胞工程、发酵工程、蛋白质工程和现代分子检测技术又相互融合，相互穿插，与基因工程技术构成了一个既有中心，又各有侧重点，又相互联系的密不可分的有机整体。基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。细胞工程：也称细胞技术，以细胞为基本单位，在离体条件进行培养或人为的精细操作，使细胞在体外大规模繁殖，以获得具有新性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物。蛋白质工程：通过生物技术对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造，以便获得更适合人类需要的蛋白质产品的技术。发酵工程：利用生物细胞（或酶）的某种特性，通过现代化工业技术手段进行工业规模化生产的技术。酶工程：利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程、发酵工程相结合形成的一门新技术。下游工程是指从基因工程获得的动、植物和微生物的有机体或器官中，从细胞工程、发酵工程和酶工程产物（发酵液、培养液）中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用目的的过程。基因工程典型步骤：1）克隆：提取供体生物的目的基因，通过性内切酶、DNA聚合酶连接到另一个载体的DNA分子上，形成一个新的重组DNA分子2）转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存3）将那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定4）对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达。基因工程的理论基础：不同的基因具有相同的物质基础；基因是可切割和转移的；多肽与基因之间存在对应关系，并且有着相同的遗传密码；基因的遗传物质是可以遗传的。DNA的凝胶电泳原理：带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。生理条件下，DNA、RNA带负电荷，在电场中会向正极方向迁移。电泳迁移率同电场强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。由于结构的重复性，相同数量的双链DNA几乎具等量的电荷，能以同样的速度向正极迁移。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于大小和形状。下载本文