一、设计引物前应做的准备：准备载体图谱，大致准备把片段插在哪个部分，对片段进行酶切分析，确定哪些酶切位点不能用，准备一本公司酶的商品目录，便于查询各种酶的数据及两种酶是否可以配用。2.设计引物所要考虑的问题是两个位点应是载体上的，所以连接片段上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好是隔4隔。两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用双酶切有共同的buffer的酶。
二、Tm。设计引物的时候先不管5端的修饰序列，把互补区的T值控制在55度以上，在加上酶切位点和保护碱基。高的T值引物就比较容易克服3端发卡，二聚体及3’非特异结合等问题。
三、引物间的自由能的绝对值，如果小于10一般是问题不大的。如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果3，端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时候也可以降低二聚体的自由能。在设计酶切位点时最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为一个特异性引物一般都是20bp左右，在加上酶切位点序列和保护碱基，大致就是28bp。
四、设计时性酶切位点应该是在5端的顶端。在设计引物时，常在5端添加酶切位点，以利于PCR产物连接到载体。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先利用软件设计出合适的引物，引物的3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3端的第一位碱基是A.（容易错配）引物3端最佳碱基是G或C，行程的碱基比较稳定。
五、酶切位点都需要保护碱基，以利于内切酶的有效切割，酶切位点前加保护碱基1，两个酶切位点至少隔上3个碱基，在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点，还要在两端加一个3个核算的保护序列，否则PCR产物很难被酶切，因此就会导致连接失败，因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，有的酶是可以切割的，比如：Shali和SpeI,他们不需要辅助性碱基即可切割。但大部分酶是需要辅助性碱基的。所以引物顺序应是5，-保护碱基+酶切位点+引物配对区---3， ，只要在5，端加保护碱基就可以了。其实保护碱基就是要给性内切酶一个结合位点，3端还有更长的引物序列存在。下载本文
