根据不同的试验目的,外援DNA导入哺乳动物细胞有两种类型:瞬时转染和稳定转染。瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的载体上,不整合到细胞的染色体上,在外源基因导入细胞1-4天后收获细胞进行分析;稳定转染需要外源基因整合到细胞的染色体上,从而得到稳定的转染细胞株。
细胞转染有以下几种方法:
DEAE-葡聚糖:这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的核酸磷酸骨架,相互作用形成的复合物被细胞内吞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染,相对简便、可重复性好,但对细胞有一定的毒副作用。转染时要除掉血清。
磷酸钙共沉淀转染:最早在1973年开始采用。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混合,形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面,借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要,pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响,重复性不佳。此法操作简便,可用于稳定转染、瞬时转染,但不适用于原代细胞。
电穿孔法:通过短暂的高电场电脉冲处理细胞,高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入细胞。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆的伤害细胞膜而裂解细胞。可用于各种细胞。但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。
脂质体法:带正电的脂质体与带负电的DNA结合,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞进入细胞。脂质体法始于1987年,此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。但转染时需除去血清。适用于各种细胞,可用于稳定转染及瞬时转染。
病毒介导法:通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中。①逆转录病毒:用于稳定转染,可用于难转染的细胞(原代细胞、体内细胞等),但携带基因不能太大,细胞需处于期。②腺病毒:用于瞬时转染,可用于难转染的细胞。此法需考虑安全问题。
显微注射法:用显微镜将DNA直接注入靶细胞核。可用于稳定转染及瞬时转染。但转染细胞数有限。多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。下载本文